Приложение наUltrafiltration inEизвличане наNестественоCолаген

 

Ⅰ.Какво е колаген

Колагенът е биополимер, основният компонент в съединителната тъкан на животните, а също и най-изобилният и широко разпространен функционален протеин при бозайниците, съставляващ 25%–30% от общия протеин и дори до повече от 80% при някои организми. Играе ролята на свързваща тъкан в животинските клетки.

Според измерването възрастен има около 3 kg колаген в тялото си, който присъства главно в кожата, костите, очите, зъбите, сухожилията, вътрешните органи (включително сърцето, стомаха, червата и кръвоносните съдове) и други части на човешкото тяло. Неговата функция е да поддържа морфологията и структурата на кожата и органите, а също така е важна суровина за възстановяване на увредени тъкани.

II. Екстракция на колаген от люспи на бял амур чрез ултрафилтрация

1. Материали и методи

1.1 Тестови проби

Воден екстракт от суров колаген.

1.2 Методи за изпитване

1.2.1 Процес на ултрафилтрация

1.2.2 Определяне на процеса на предварително филтриране

В този тест оптималният процес на предварителна филтрация се определя чрез сравнителен анализ на метода на вакуумна филтрация и метода на микрофилтрация. Специфичните методи за изпитване са както следва:

① Суровият воден екстракт от колаген се филтрира чрез метод на вакуумна филтрация с филтърна хартия, за да се отстранят суспендираните частици и примесите във водния екстракт.

② Суровият воден екстракт от колаген се филтрира с 0.2 μm микрофилтрационна мембрана за отстраняване на неразтворими вещества, примеси и др. във водния екстракт.

1.2.3 Избор на размер на порите на ултрафилтрационната мембрана

По време на пречистването размерът на порите на ултрафилтрационната мембрана е 100 kDa.

1.2.4 Експеримент с един фактор на процеса на ултрафилтрационно пречистване

Водният екстракт от суров колаген се пречиства чрез ултрафилтрационна технология. Проучете еднофакторния експеримент за ефекта на работното налягане, работната температура и pH върху задържането на колаген. След стартиране на оборудването за ултрафилтрация за определен период от време, проучете ефекта на различни фактори върху степента на задържане на колаген.

1.2.5 Формула за изчисление

2. Резултати и анализ

2.1 Анализ на процеса на предварително филтриране

Вижте таблицата по-долу за резултатите от сравнението на метода на вакуумна филтрация и метода на микрофилтрация.

Метод на филтриране	Концентрация на разтвора преди филтриране/(g/L)	Концентрация на разтвора след филтриране/(g/L)	Сензорни феномени
метод на вакуумна филтрация	0.45	0.35	Разтворът е бистър в края на филтрирането, но става мътен, след като престои известно време.
метод на микрофилтрация	0.45	0.42	Разтворът е бистър в края на филтрирането и остава бистър, след като се остави за определен период от време

 

От таблицата може да се види, че както методът на вакуумна филтрация, така и методът на микрофилтрация могат да премахнат примесите и неразтворимите твърди вещества в разтвора, но методът на микрофилтрация има по-добър защитен ефект върху протеина, тоест загубата не е значителна и методът на вакуумна филтрация може да причини загуби на протеин. В допълнение, филтратът е мътен, след като е бил поставен за определен период от време чрез вакуумна филтрация, докато микрофилтрацията е все още бистра и прозрачна, така че микрофилтрацията е избрана като процес на предварителна обработка на ултрафилтрация.

2.2 Еднофакторен тест на процеса на ултрафилтрация

2.2.1 Ефект на ултрафилтрационното налягане върху степента на задържане

При условия на температура 40 градуса и pH 9.0, проучете ефектите от различни ултрафилтрационни налягания (0.07MPa, 0.{ {11}}9MPa, 0,11MPa, 0,13MPa и 0,15MPa) върху степента на задържане на протеини. Резултатите са показани на фигурата по-долу.

 

Както може да се види от горната фигура, с увеличаването на работното налягане скоростта на прихващане на протеина постепенно намалява. При {{0}}.07MPa степента на задържане на протеин е 96,53%, когато работното налягане е 0,15MPa, степента на задържане на протеин е 84,38%. Това е така, защото разделянето на вещества чрез ултрафилтрация се задвижва от разликата в налягането. В този диапазон на ниско работно налягане малкомолекулното вещество може бързо да премине през мембраната, но макромолекулните вещества могат да бъдат уловени от ултрафилтрационната мембрана и да се натрупат на повърхността на мембраната и в момента повърхността на мембраната и водната фаза извлечете разликата в концентрацията, за да предизвикате поляризационна устойчивост на разликата в концентрацията; въпреки това, с увеличаване на налягането съпротивлението на поляризация на концентрацията постепенно се увеличава и разликата в концентрацията между повърхността на мембраната и водния екстракт достига равновесие. Когато налягането надвиши това равновесие, върху повърхността на мембраната може да се напише слой гел (което е в съответствие с теорията за поляризацията на концентрацията и слоя гел, образуван по време на ултрафилтрация). Налягането продължава да се увеличава и дебелината на слоя гел се увеличава, а протеинът, оставащ на повърхността на мембраната, се увеличава, което води до ниска степен на задържане. За да се осигури ефектът на разделяне на мембраната, оптималният параметър на работно налягане е 0,07MPa.

2.2.2 Ефект на температурата върху степента на задържане на протеини

При условие на налягане {{0}}.11MPa, pH 9,0, проучете ефектите на различните температури (25 градуса, 30 градуса, 35 градуса, 40 градуса и 45 градуса) върху задържането на протеин. Резултатите са показани на фигурата по-долу.

 

Както е показано на фигурата по-горе, с повишаването на температурата степента на задържане на ултрафилтрационната мембрана се увеличава постепенно и достига максимума при 45 градуса, като степента на задържане е 97,01%. Тъй като вискозитетът на колагена е тясно свързан с температурата: когато температурата е по-ниска, вискозитетът на колагена е по-голям и по този начин колагенът лесно образува устойчивост на повърхността на мембраната, което води до ниска степен на задържане. Когато температурата се повиши, вискозитетът на колагена намалява и взаимодействието между колагеновите молекули се отслабва, така че скоростта на пренос на маса се увеличава и поляризацията на концентрацията се отслабва, като по този начин се увеличава степента на задържане. Друга причина за увеличаването на степента на задържане е, че температурата се повишава и съответно се увеличава разтворимостта на колагена и се намалява феноменът на блокиране на мембраната от колаген. Следователно оптималната температура за ултрафилтрация е 45 градуса.

2.2.3 Ефект на pH върху задържането на протеини

При условие на налягане {{0}}.11MPa и температура 40 градуса, проучете ефектите от различни условия на pH, а именно pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 и pH=10.0, върху скоростта на задържане. Резултатите са показани на фигурата по-долу.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, степента на задържане нараства постепенно с повишаването на pH. Това е така, защото ултрафилтрационната мембрана е полиетерна кленова мембрана с отрицателен заряд, колаген с отрицателен заряд при алкални условия, отрицателно заредени колагенови молекули и ултрафилтрационна мембрана със същия заряд образуват взаимно изключващо се състояние, така че молекулите на колагена не могат лесно да останат на повърхността на мембраната, не е лесно да се блокира мембраната, така че оптималното pH на ултрафилтрацията е 8-10.

2.3 Оптимизиране на процеса на ултрафилтрация и валидиране на резултатите

Анализът от софтуера Design-Expert8.05 показва, че оптималните параметри на процеса са следните: работно налягане 0.14MPa, работна температура 40,98 градуса и pH на разтвора=9.43. При тези условия процентът на задържане е 92,551%. Като се има предвид работоспособността на действителните параметри, работното налягане е 0,14MPa, работната температура е 40 градуса, а стойността на pH на захранващата течност е 9,50 при условията на ултрафилтрация. Експерименталната проверка започва, след като системата на ултрафилтрационното устройство е започнала да бъде стабилна. Полученият резултат за процент на задържане е (92.61 0.1)% (n=3). Предсказаната стойност на уравнението е основно подобна на измерената стойност, което показва, че прогнозираният резултат от условния параметър е в съответствие с действителния условен резултат.

2.4 Резултати от електрофореза

Пречистеният колаген се анализира чрез SDS-PAGE електрофореза и резултатите са показани на фигурата по-долу.

Както е показано на фигурата по-горе, лента 1 е пречистеният колаген в този експеримент, а лента 2 е стандартната колагенова проба от сухожилието на прасеца. Може да се види от SDS-PAGE електрофорезата, че колагеновият протеин, предложен в този експеримент, може да бъде идентифициран като колаген, но привидно неясните граници на a1 пептидна верига и a2 пептидна верига не са ясни. От електрофорезата става ясно, че няма други протеинови ленти и може да се заключи, че чистотата на пречистения колаген е висока.