Приложение на ултрафилтрацията при извличане на естествен колаген
Колагенът, като естествен протеинов ресурс, има добра биосъвместимост, ниска антигенност, биоразградимост и хемостаза, стегната спирална структура и собствени характеристики, всички от които осигуряват предпоставки за неговата индустриализация. Колагенът и неговите вторични продукти не се използват само като опаковъчни материали, козметика и продукти за здравеопазване, но и като хранителни добавки за подобряване на месния продукт и играе важна роля, особено в областта на медицината.
Какво е колаген?
Колагенът е биологична макромолекула, основният компонент на животинската съединителна тъкан и най-изобилният и широко разпространен функционален протеин при бозайниците, представляващ 25% до 30% от общия протеин и дори до 80% или повече в някои организми. Играе ролята на свързваща тъкан в животинските клетки.
Измерено е, че тялото на възрастен има около 3 kg колаген, който се съдържа главно в човешката кожа, кости, очи, зъби, сухожилия, вътрешни органи (включително сърце, стомах, черва, кръвоносни съдове) и други части на човешкото тяло, и неговите функцията е да поддържа морфологията и структурата на кожата и тъканите и органите, а също така е важна суровина за възстановяването на различни тъкани след нараняване.
Има много видове колагенови протеини, като често срещаните типове са тип I, тип II, тип III, тип V и XI. Поради добрата си биосъвместимост, биоразградимост и биоактивност, колагенът се използва широко в храните, медицината, тъканното инженерство, козметиката и други области.
Как да извлечем естествен колаген
Животинските тъкани от добитък и птици са основният начин хората да получат естествен колаген и неговите колагенови пептиди. Въпреки това, поради свързани болести по животните и някои религиозни вярвания, употребата на колаген и неговите продукти от сухоземни бозайници е ограничена и развитието постепенно се насочва към морските организми. Европейският орган за безопасност на храните (EFSA) потвърди, че дори колагенът, получен от животински кости, няма потенциал да зарази болестта луда крава и други свързани заболявания. Поради разликите в аминокиселинния състав и степента на омрежване, водните животни, особено колагенът, богат на отпадъци от тяхната обработка като кожа, кости и люспи, имат много предимства, които животинският колаген няма. В допълнение, колагенът, получен от морски животни, очевидно превъзхожда колагена от сухоземни животни в някои аспекти, като ниска антигенност и хипоалергенност. Следователно водният колаген може постепенно да замени колагена от сухоземни животни. За пример беше взет процесът на извличане на колаген от люспите на бял амур.
Екстракция на колаген от люспи на бял амур чрез ултрафилтрационен метод
1. Материали и методи
1.1 Тестова проба
Воден екстракт от суров колаген.
1.2 Методи за изпитване
1.2.1 Процес на ултрафилтрация
1.2.2 Определяне на процеса на предварително филтриране
В този тест методът на вакуумна филтрация и методът на микрофилтрация се сравняват и анализират, за да се определи най-добрият процес на филтриране преди филтриране. Специфичните методи за изпитване са както следва:
① Суровият воден екстракт от колаген се филтрира чрез вакуумно изпомпване на филтърна хартия, за да се отстранят суспендираните частици и примесите във водния екстракт.
② Суровият воден екстракт от колаген се филтрира през 0.2μm микрофилтрационна мембрана за отстраняване на неразтворимите вещества и примесите във водния екстракт.
1.2.3 Избор на размер на порите на ултрафилтрационната мембрана
Размерът на порите на ултрафилтрационната мембрана е 100 kDa.
1.2.4 Експеримент с един фактор на процеса на ултрафилтрационно пречистване
Технологията на ултрафилтрация беше използвана за пречистване на суровия воден екстракт от колаген и бяха изследвани еднофакторни експерименти за ефектите на работното налягане, работната температура и pH стойността върху задържането на колаген. След като оборудването за ултрафилтрация беше пуснато за определен период от време и стабилизирано, беше изследвано влиянието на различни фактори върху задържането на колаген.
1.2.5 Формула за изчисление
2. Резултати и анализ
2.1 Резултати от анализа на процеса на предварително филтриране
Резултатите от сравнението на двата метода на филтриране на вакуумна екстракция и микрофилтруване са показани в следващата таблица.
От таблицата може да се види, че както методът на вакуумна филтрация, така и методът на микрофилтрация могат да премахнат примесите и неразтворимите твърди вещества в разтвора, но методът на микрофилтрация има по-добър защитен ефект върху протеините, тоест загубата не е очевидна, а методът на вакуумна филтрация е лесно причинява загуба на протеини. В допълнение, методът на вакуумно филтриране показва мътност, след като филтратът е поставен за определен период от време, а микрофилтратът е все още бистър и прозрачен, така че микрофилтрацията е избрана като процес на предварителна обработка на ултрафилтрацията.
2.2 Еднофакторен тест на процеса на ултрафилтрация
2.2.1 Влияние на ултрафилтрационното налягане върху степента на задържане
При условие на температура 40 градуса и pH=9.0, влиянието на различни ултрафилтрационни налягания (0.07MPa, {{9} }.09MPa, 0,11MPa, 0,13MPa и 0,15MPa) върху задържането на протеин е изследвано. Резултатите са показани на фигурата по-долу.
 |
Както може да се види от фигурата по-горе, с увеличаването на работното налягане степента на задържане на протеин постепенно намалява. Когато работното налягане е {{0}}.07MPa, степента на задържане на протеин е 96,53%, а когато работното налягане е 0,15MPa, степента на задържане на протеин е 84,38%. Това е така, защото ефектът на разделяне на ултрафилтрацията върху веществата се осъществява от разликата в налягането. В диапазона на ниско работно налягане малките молекули могат бързо да преминат през мембраната, докато големите молекули могат да бъдат уловени от ултрафилтрационната мембрана и да се натрупат на повърхността на мембраната. По това време повърхността на мембраната и водният екстракт образуват разлика в концентрацията, което води до устойчивост на поляризационна концентрация. По това време налягането е сравнително ниско и не може да окаже голямо влияние върху степента на задържане. Въпреки това, с увеличаване на налягането, съпротивлението на поляризация на концентрацията постепенно се увеличава и разликата в концентрацията между повърхността на мембраната и водния екстракт достига равновесие. Когато налягането надвиши това равновесие, върху повърхността на мембраната може да се образува слой гел (което е в съответствие с теорията, че по време на ултрафилтрация се образуват концентрационна поляризация и кондензационен слой), и налягането продължава да се увеличава, дебелината на слоя гел се увеличава , а протеинът, оставащ на повърхността на мембраната, също се увеличава. Това води до по-нисък процент на задържане. За да се осигури ефектът на разделяне на мембраната, оптималният параметър на работното налягане е 0,07MPa.
2.2.2 Влияние на температурата върху задържането на протеини
При условията на {{0}}.11MPa налягане и pH=9.0, ефектите на различни температури, а именно 25 градуса, 30 градуса, 35 градуса, 40 градуса и 45 градуса, върху протеина задържане са изследвани. Резултатите са показани на фигурата по-долу.
Както може да се види от фигурата по-горе, степента на задържане на ултрафилтрационната мембрана постепенно се увеличава с повишаването на температурата и достига максимума при 45 градуса, със степен на задържане от 97,01%. Това е така, защото вискозитетът на колагена е тясно свързан с температурата. Когато температурата е ниска, вискозитетът на колагена е по-голям и натрупването на колаген върху повърхността на мембраната е лесно за образуване на устойчивост, което води до ниска степен на задържане. Когато температурата се повиши, вискозитетът на колагена намалява, взаимодействието между молекулите на колагена се отслабва и скоростта на пренос на маса се увеличава, феноменът на поляризация на концентрацията се отслабва и скоростта на задържане се увеличава. Друга причина за увеличаването на степента на задържане е, че температурата се повишава, разтворимостта на колагена също се увеличава съответно и феноменът на колаген, блокиращ мембраната, се намалява, така че оптималната температура на ултрафилтрация е 45 градуса.
2.2.3 Влияние на рН стойността върху задържането на протеин
При условията на {{0}}.11MPa налягане и 40 градуса температура, влиянието на различни условия на pH, а именно pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 и pH=10.0, върху скоростта на задържане е изследвано. Резултатите са показани на фигурата по-долу.
 |
As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, степента на задържане постепенно се увеличава с увеличаване на стойността на pH. Това е така, защото ултрафилтрационната мембрана е полиетерна кленова мембрана с отрицателен заряд, а колагенът е отрицателно зареден при алкални условия. Отрицателно заредените колагенови молекули образуват взаимно изключващо се състояние с ултрафилтрационната мембрана със същия заряд, поради което колагеновите молекули не могат лесно да останат на повърхността на мембраната и да блокират мембраната. Следователно оптималната рН стойност на ултрафилтрацията е 8-10.
2.3 Оптимизиране на процеса на ултрафилтрация и проверка на резултатите
Според анализа на софтуера Design-Expert8.05 оптималните параметри на процеса са: работно налягане 0.14MPa, работна температура 40.98 градуса, pH на разтвора{{7 }}.43, а степента на задържане е 92,551%. Като се има предвид работоспособността на действителните параметри, условията на ултрафилтрация бяха избрани като 0,14MPa работно налягане, 40 градуса работна температура и 9,50 рН стойност на разтвора на материала и тестовата проверка беше стартирана, след като системата за ултрафилтрация беше стартирана и стабилизирана. Резултатът от степента на задържане беше (92,61±0,1) % (n=3). Прогнозираните стойности на уравнението са в общи линии подобни на измерените стойности, което показва, че прогнозираните резултати от параметъра на състоянието са в съгласие с резултатите от действителните условия.
2.4 Резултати от електрофоретичен анализ
Пречистеният колаген се анализира чрез SDS-PAGE електрофореза и резултатите са показани на следващата фигура.
Както може да се види от фигурата по-горе, лента 1 е пречистеният колаген от този тест, а лента 2 е стандартната колагенова проба от сухожилие на прасеца. Може да се види от SDS-PAGE електрофореза, че колагенът в това изследване може да бъде идентифициран като колаген, но границите между a1 пептидна верига и a2 пептидна верига изглежда не са ясни. От електрофоретичната карта може да се види, че няма друг протеинов примес, така че може да се заключи, че пречистеният колаген е с висока чистота.
Относно Guidling
Guidling Technology е национално високотехнологично предприятие, фокусирано върху биофармацевтични продукти, клетъчни култури, пречистване и концентрация на биомедицина, диагностика и индустриални течности. Ние успешно разработихме центробежни филтърни устройства, ултрафилтрационни и микрофилтрационни касети, вирусен филтър, TFF система, дълбочинен филтър, кухи влакна и т.н. Които напълно отговарят на сценариите за приложение на биофармацевтични продукти, клетъчни култури и т.н. Нашите мембрани и мембранни филтри се използват широко при концентрация, екстракция и разделяне на предварителна филтрация, микрофилтрация, ултрафилтрация и нанофилтрация. Нашите многобройни продуктови линии, от малка лабораторна филтрация за еднократна употреба до производствени филтриращи системи, тестове за стерилност, ферментация, клетъчни култури и други, отговарят на нуждите от тестване и производство. Guidling Technology очаква с нетърпение да си сътрудничи с вас!
