Основни принципи и работен процес на пептиден синтез в твърда{0}}фаза (SPPS)

Пептиден синтез в твърда{0}}фаза (SPPS)е метод за синтезиране на пептиди върху твърда подложка. Основните SPPS стратегии включватМетод Bocи наFmoc метод. Пептидният синтез е повтарящ се процес на последователно добавяне на аминокиселини и обикновено се извършва отС{0}}край (карбоксилен край)къмN-край (амино край). Първо, карбоксилната група на първата аминокиселина на целевия пептид е ковалентно свързана към твърда подложка (смола). Използвайки аминогрупата на тази аминокиселина като начална точка, N-крайната защитна група се отстранява и нарастващата пептидна верига се удължава чрез реакция с излишък от активирана втора аминокиселина. Този цикъл-свързване → измиване → премахване на защитата → неутрализация и измиване → следващо свързване- се повтаря, докато се постигне желаната дължина на пептида. Накрая, пептидната верига се разцепва от смолата и се пречиства, за да се получи целевият пептид. Когато -аминогрупата е защитена сBoc (трет-бутилоксикарбонил), методът се наричаBoc-базиран твърд{1}}фазов пептиден синтез. Когато -аминогрупата е защитена сFmoc (9-флуоренилметилоксикарбонил), известен е катоFmoc-базиран твърд{1}}фазов пептиден синтез.

 

Boc-основан на твърдо{1}}фазов пептиден синтез (Boc метод)

ВМетод Boc, Вос групи, отстраними от трифлуорооцетна киселина (TFA)се използват за защита на -аминогрупите, докатобензил-тип защитни груписе използват за странични вериги. По време на синтеза Boc-защитена -аминокиселина първо е ковалентно свързана със смолата. След това Вос групата се отстранява с TFA и полученият свободен амино край се неутрализира с триетиламин. Следващата аминокиселина се активира с помощта наDCC (дициклохексилкарбодиимид)и свързани за удължаване на пептидната верига. След завършване на сглобяването целевият пептид се отцепва от смолата с помощта на силна киселина, обикновенобезводен флуороводород (HF)илитрифлуорометансулфонова киселина (TFMSA)В метода на Boc синтез се изискват многократни киселинни обработки за отстраняване на защитните групи преди всяка стъпка на свързване. Това може да доведе до няколко странични реакции, като преждевременно разцепване на пептида от смолата и нестабилност на аминокиселинните странични вериги при киселинни условия, което води до нежелани странични реакции.

 

Fmoc-основан на твърдо{1}}фазов пептиден синтез (Fmoc метод)

в1978, Майенхофер и Атертънразработи стратегия за пептиден синтез, използвайкиFmoc (9-флуоренилметилоксикарбонил)като -амино защитната група, известна катоFmoc метод. При този подход -аминогрупата е защитена сбазов-лабилен Fmoc, докато страничните вериги са защитени скиселина-лабилни Boc-тип защитни групи.Основно предимство на Fmoc като амино-защитна група е нейнотостабилност при киселинни условия; не се повлиява от третиране с реагенти като напртрифлуорооцетна киселина (TFA)и може да бъде селективно премахнат с помощта намека основа. В същото време защитните групи на страничната -верига като Вос са стабилни при основни условия и се отстраняват при киселинно третиране. Накрая пептидът се разцепва количествено от смолата с помощта наTFA/дихлорометан (DCM), като се избягва използването на силни киселини и по този начин се подобрява безопасността и съвместимостта с рутинния пептиден синтез.

 

История на развитието на твърдо{0}}фазовия пептиден синтез (SPPS)

1. Основополагащ етап (началото на 20-ти век до 1963 г.)

в1902, Емил Фишербеше първият, който изследва пептидния синтез, но напредъкът беше бавен поради технически ограничения. Използвани ранни синтезибензоил и ацетил защитни групи, които трудно се премахваха и често водеха доразцепване на пептидна верига.

в1932, Макс Бергмани -колеги представихабензилоксикарбонилна (Z) групакато -амино защитна група. Тази група може да бъде премахната подкаталитично хидрогениране или киселинни условия, предоставяйки по-надежден инструмент за пептиден синтез и поставяйки основата за развитието на твърд{0}}фазовия пептиден синтез през 60-те години на миналия век.

По време на1950s, учените успешно синтезираха различнибиологично активни пептиди, като напрокситоцин и инсулин. Тези постижения напреднаха още повече в пептидната химия и поставиха основата за появата на твърд{1}}фазов пептиден синтез.

 

2. Пионерски етап (1963)

в1963, Робърт Б. Мерифийлдпредложи наметод на пептиден синтез в твърда{0}}фаза (SPPS)., в който наC-терминална аминокиселинае закотвен към опора от смола и пептидната верига се удължава чрез повтарящи се цикли напремахване на защитата и свързване. Този подход значително опрости процеса на пептиден синтез и станапредпочитан методза сглобяване на пептиди.

Мерифийлд използваBoc (трет-бутилоксикарбонил)за защита на -амино групата. До края на 60-те години той също разработвапървият напълно автоматизиран пептиден синтезатори успешно синтезиранбиологични протеиникато напримеррибонуклеаза (124 аминокиселини). За тези новаторски постижения Мерифийлд беше награден сНобелова награда за химия през 1984 г.

 

3. Етап на технологични иновации (1972)

в1972, Лу Карпиноразработи9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) защитна група, което може да бъденежно отстранен при основни условия, намаляване на страничните реакции. Това го прави особено подходящ засложни пептидииавтоматизиран синтез.

TheFmoc методпостепенно замени метода Boc като основна стратегия. Автоматизирани пептидни синтезатори, базирани на дветеFmoc и Boc химиявпоследствие са разработени, задвижвайкиавтоматизация на пептидния синтези значително подобряване на ефективността и възпроизводимостта.

 

4. Етап на зрялост и разширяване (1990 г. до днес)

Оптимизиране на смола и реагент:Развитие нависоко{0}}натоварващи, хидрофилни PEG-модифицирани смолии ефективни свързващи реагенти катоHBTUиХАТУзначително подобри ефективността и добива на твърд{0}}фазовия пептиден синтез (SPPS).

Технологична интеграция:Нови подходи катомикровълнов -асистиран синтезихимия на потокаимат съкратени времена за реакция и допълнително увеличени добиви.

 

Основни принципи и работен процес на SPPS:
Основният принцип на пептидния синтез в твърда{0}}фаза епоетапно изграждане на пептидна верига върху твърда подложка, използвайкизащита на груповите стратегиииреакции на кондензация (свързване).да се постигнеефективно и контролируемо сглобяване на пептиди.

1. Роля на твърдата опора (смола) в синтеза на пептиди в твърда-фаза (SPPS)

A неразтворима полимерна смола-катополистирол-дивинилбензен кръстосано-смола, смола Wang или амидна смола Rink-е избрано като солидна опора в SPPS. Повърхността на смолата съдържафункционални групи(напр. хидроксилни или амино групи), които могат да се образуватковалентни връзки с единия край на пептидната верига, обикновеноC-край, закрепвайки пептида към твърдата опора. Това ковалентно прикрепване гарантира, че нарастващият пептидостава свързан със смолата през целия синтез, което силноулеснява последващите етапи на реакция, промиване и пречистване

 

2. Защита на груповата стратегия при пептиден синтез в твърда-фаза (SPPS)

По време на пептидния синтез,-аминогрупа, карбоксилна група и реактивни странични{1}}верижни функционални групина аминокиселини (като тиолови, карбоксилни и амино групи) са склонни къмстранични реакции. За да предотвратите тези нежелани реакции,защитаващи груписе използват. Общите защитни групи включват:-Аминозащитни групи:

Boc (трет-бутилоксикарбонил):Киселинно{0}}лабилен, лесно се отстранява подкиселинни условия.

Fmoc (9-флуоренилметилоксикарбонил):Стабилен при киселинни условия, може да се отстрани подосновни условия(напр. пиперидин/DMF разтвор).Групи за защита на странични-вериги:Избрани според химичните свойства на страничната верига на аминокиселината. често срещаните групи включватбензил (Bn), tert-бутил (tBu), тритил (Trt), и т.н. Тези групи саотстранени в края на синтеза, обикновено по време на пептидно разцепване от смолата, използвайкикиселина или други специфични условия.

 

3.C-Краен към N-Краен синтез в SPPS

втвърд{0}}фазов пептиден синтез (SPPS), пептидното сглобяване обикновено започва приС{0}}край (карбоксилен край)и продължава стъпаловидно къмN-край (амино край). Това е така, защото наC-крайната аминокиселина първо се прикрепя към твърдата подложка, а следващите аминокиселини се свързват къмсвободна амино група на пептидната верига, вече свързана със смолата, като постепенно удължава пептидната верига.

 

4. Реакция на свързване при пептиден синтез в твърда-фаза (SPPS)

Трябва да има защитени аминокиселиниактивирантака че технитекарбоксилните групи стават реактивни, което им позволява да образуват aпептидна връзкас аминогрупата на пептида,-свързан със смолата. Честиактивиращи реагентивключваткарбодиимиди(напр. DCC, DIC),HOBt, ХАТУ, иPyBOP. Веднъж активирана, карбоксилната група реагира със свободната аминогрупа в aреакция на кондензация, образувайки анамидна връзкаи по този начин прикрепя новата аминокиселина към нарастващата пептидна верига.

 

5. Повтарящи се (циклични) операции в твърдо-фазов пептиден синтез (SPPS)

Процесът включваповтаряне на цикъла на премахване на защитата → свързване → измиване, добавяйкиедна аминокиселина на цикълза постепенно удължаване на пептидната верига. След всякареакция на свързване, смолата еизмити(напр. с разтворители като DMF или DCM) за отстраняване на нереагирали реагенти, странични -продукти и излишни аминокиселини. The-амино групата на новодобавения остатък след това се премахва защитата, излагане на свободен амин за подготовка за следващата реакция на свързване. Този цикъл се повтаря, докато желаната пептидна последователност бъде напълно сглобена.

 

6. Разцепване в твърд{1}}фазов пептиден синтез (SPPS)

След като пептидната верига достигне желаната дължина, тя еотцепен от твърдата опорас помощта на подходящ реагент, докато едновременнопремахване на всички защитни групи. Често използван реагент за разцепване етрифлуорооцетна киселина (TFA), което не самопрекъсва връзката между пептида и смолатано също такапремахва защитните групикато Fmoc и Boc, възстановявайки пептида до неговияродна държава. След като пептидната верига достигне желаната дължина, тя еотцепен от твърдата опорас помощта на подходящ реагент, докато едновременнопремахване на всички защитни групи. Често използван реагент за разцепване етрифлуорооцетна киселина (TFA), което не самопрекъсва връзката между пептида и смолатано също такапремахва защитните групикато Fmoc и Boc, възстановявайки пептида до неговияродна държава.

Чрез тези стъпки,твърд{0}}фазов пептиден синтез (SPPS)позволява наефективно и контролирано сглобяване на пептидни вериги върху твърда подложка, като се избягват сложните междинни етапи на пречистване, изисквани в традиционния синтез на разтвор-фаза и значителноподобряване на ефективността на синтеза и добива.

Чрез тези стъпки,твърд{0}}фазов пептиден синтез (SPPS)позволява наефективно и контролирано сглобяване на пептидни вериги върху твърда подложка, като се избягват сложните междинни етапи на пречистване, изисквани в традиционния синтез на разтвор-фаза и значителноподобряване на ефективността на синтеза и добива.