Процес на концентрация на ултрафилтрация/диафилтрация надолу по веригата: Как ефективно да предотвратите проникването и загубата на целевия протеин

Процес на концентрация на ултрафилтрация/диафилтрация надолу по веригата: Как ефективно да се предотврати проникването и загубата на целеви протеини

В процесите на пречистване надолу по веригата за рекомбинантни протеини, кръвни продукти и други биологични продукти ултрафилтрацията/диафилтрацията (UF/DF) се използва за концентриране на суровината, обмен на буфер и отстраняване на соли и примеси от малки-молекули. Разделянето се постига на базата на мембранно пресяване: големи молекули като моноклонални антитела (mAbs) се задържат от мембраната, докато соли, ендотоксини, свободни протеини на клетката гостоприемник (HCPs) и други малки -молекулни примеси преминават през мембраната и се отстраняват в пермеата. По време на мащабиране-на процеса може лесно да възникне целева загуба на протеин през мембраната, което директно намалява добива и увеличава партидните разходи. При някои работни условия протеин може да бъде открит в пермеата, което изисква бързо определяне на това дали изтеклите компоненти са непокътнати целеви mAb, разградени/фрагментирани агрегати или протеини на клетка гостоприемник. Тази статия е разделена на две основни части: прави преглед на традиционни-подходи за контрол на процеса и, в комбинация с Дизайн на експерименти (DOE), установява стабилен прозорец на процеса, подкрепен от множество аналитични методи за определяне на идентичността на протеините, открити в пермеата.

 

 

I. Основни причини за проникване на целевия протеин през мембраната по време на UF/DF

1. Прекомерно трансмембранно налягане (TMP)
Когато разликата в налягането през мембраната е твърде голяма, съпротивлението на разтворителя се засилва, принуждавайки малко мономерен протеин в пермеата. По време на-увеличаване на мащаба захранващият резервоар съдържа по-голям обем материал и колебанията на налягането в тръбопровода са по-изразени, което прави преходното свръхналягане по-вероятно, отколкото в лабораторен мащаб.

2. Неправилен тангенциален дебит
Ако скоростта на потока е твърде ниска, върху повърхността на мембраната се образува плътен концентрационен-поляризационен слой и локалната протеинова концентрация може да надхвърли прага на поносимост на мембраната. Ако скоростта на потока е твърде висока, напрежението на срязване може да причини структурно разцепване на mAb, генерирайки по-малки протеинови фрагменти, които могат да преминават свободно през порите на мембраната.

3. Прекалено висока концентрация на протеин в суровината
Когато концентрацията на протеин във фуража е твърде висока, протеинът се натрупва на повърхността на мембраната и малко мономерен протеин може да бъде пренесен в пермеата. Това е често срещан проблем при широко{1}}производство.

4. pH или проводимост извън обхвата на процеса
Промените в характеристиките на заряда на протеина могат да намалят неговия радиус на хидратация и привидния размер на частиците, което води до необичайно проникване на мембраната.

5. Стареене на мембранната касета, висок дифузионен поток или недостатъчно предварително-кондициониране
Физическите дефекти в мембранната касета могат директно да причинят изтичане на протеин и да представляват риск,-свързан с оборудването. Повтарящата се CIP със силно алкални разтвори може постепенно да повреди полиетерсулфоновия (PES) мембранен материал.

6. Прекомерен диафилтрационен обем
По време на продължителна диафилтрация, непрекъснатото промиване с разтворител може постепенно да отнесе малки количества мономерен протеин.

 

II. Традиционни практически мерки за предотвратяване на проникването и загубата на целеви протеини

(A) Контрол на параметрите на процеса

1. Контролирайте трансмембранното налягане (TMP)
Определете горна граница за предупреждение за налягане и установете аларми за блокиране, за да предотвратите преходни въздействия на високо-налягане върху мембранния слой. След определяне на базовите параметри в малък мащаб, намалете безопасното работно налягане по време на-увеличаване на производството и запазете подходящ диапазон на толеранс на процеса.

2. Оптимизирайте скоростта на напречния поток
Установете стабилен граничен слой и намалете поляризацията на концентрацията на повърхността на мембраната чрез кръстосано протичане, като по този начин минимизирате натрупването на протеин върху повърхността на мембраната при източника.

3. Ограничете крайната концентрация след концентрация
Определете граница на концентрация въз основа на физикохимичните свойства на протеина и избягвайте прекомерната концентрация на фуража. За mAbs рутинната крайна концентрация обикновено не надвишава 50 mg/mL; за някои склонни към агрегация-mAbs, концентрацията трябва да се намали допълнително.

4. Контролирайте pH и проводимостта на храната
Поддържайте стабилен хидратиран размер на частиците на протеина и избягвайте молекулярно свиване, причинено от смущения в киселинно/основната или йонна -сила.

(B) Оборудване и оперативни контроли

1. Извършете тест за целостта на мембранната касета преди всяка партида
Извършете тест с-точка на мехурче преди производството на всяка партида, за да идентифицирате счупени мембранни влакна. Повредените мембранни касети трябва да се изхвърлят незабавно, за да се предотврати непрекъснато изтичане на протеин.

2. Стандартизирайте процедурата за CIP почистване
Контролирайте концентрацията на NaOH и времето за контакт. След силно алкално почистване, напълно уравновесете материала на мембраната, за да намалите риска от деформация на порите на мембраната.

3. Използвайте поетапна диафилтрация
Използвайте голям{0}}обмен на буферен буфер по време на ранния етап, за да премахнете солите, и забавете скоростта на диафилтрационния поток, когато крайната точка се приближава, за да намалите съпротивлението и загубата на протеин.

 

III. Създаване на пространство за проектиране на процес чрез DOE (QbD характеризиране на процеса; приложимо за подаване на IND)

1. Факторен скрининг
Прегледайте пет ключови UF/DF процесни параметъра (P): трансмембранно налягане, скорост на захранващия поток, начална протеинова концентрация, pH на захранването и работна температура.
Променливи на реакцията: задържан добив, съдържание на протеин в пермеата, мембранен поток и процент агрегати с високо -молекулно- тегло.

Чрез анализ на значимостта идентифицирайте ключовите фактори, които допринасят за изтичане на протеин.

2. Моделиране на повърхността на реакцията
Изберете четирите параметъра с най-висока значимост, за да конструирате повърхност на реакция и да анализирате взаимодействията между параметрите. При много работни условия един параметър може да остане в своя квалифициран диапазон, докато комбинацията от два параметъра може да доведе до проникване на протеин. Такива ефекти на взаимодействие не могат да бъдат идентифицирани чрез традиционни-фактор---експерименти. Въз основа на модела дефинирайте работно дизайнерско пространство. Докато параметрите на процеса остават в този диапазон, може да се осигури ефективно задържане на протеини, докато примесите се отстраняват чрез диафилтрация.

3. Предизвикателство за най-лош-случай (необходимо за характеризиране на процеса)
Изберете параметри на процеса в крайните граници на работа, за да симулирате променливостта на производството: максимална TMP, минимална скорост на напречен поток и горна-гранична концентрация на протеин. Уверете се, че дори при екстремни условия на работа не настъпва широкомащабна-целева загуба на протеин, като по този начин отговаряте на изискванията за преглед на CMC.

 

IV. Множество аналитични методи за идентифициране на протеини, открити в пермеата и разграничаване на прицелните mAb, фрагменти на разграждане и HCP

Въз основа на аналитичната ефективност, разходите и сценариите за регулаторно подаване, методите могат да бъдат разделени на две категории: бърз скрининг и потвърдително тестване. Бързите методи трябва да бъдат приоритетни за рутинно наблюдение на процеса; когато възникнат необичайни отклонения, трябва да се използват точни методи за идентифициране.

1. UV спектрофотометрия (бърз онлайн скрининг; предпочита се за рутинно наблюдение на-подове в магазини)
Съберете пермеата и измерете неговата абсорбция A280. Това може само да определи дали протеинът присъства в пермеата и не може да различи видовете протеин. Използва се главно за рутинно наблюдение на процеси. Непрекъснато нарастваща стойност на A280 показва влошаващо се изтичане на протеин и изисква незабавно спиране на диафилтрацията и изследване на процеса.

2. SDS-PAGE електрофореза (най-често използваният метод за качествена идентификация)
Използвайте редуцираща и не{0}}редуцираща електрофореза и сравнете позициите на лентите с тези на целевото mAb в суровината:
1) Ако позицията на лентата е напълно съвместима с целевото mAb, интактното mAb е проникнало в мембраната.
2) Ако се появят ленти с по-ниско{1}}молекулно-тегло, протеинът е претърпял хидролитично разцепване, генерирайки mAb фрагменти.
3) Ако ивиците са разпръснати с множество различни ленти, повечето са протеини на клетка гостоприемник (HCP) от клетки гостоприемник E. coli/CHO, а не целевият продукт.

3. Високо{1}}ефективна-изключваща хроматография (HPSEC)
Разделете компонентите според молекулния размер и сравнете техните времена на елуиране с тези на хроматограмата на суровината:
- Основен пик със същото време на задържане като mAb показва непокътнат целеви протеин.
- Пик, който се елуира по-рано, показва високо{1}}молекулно-агрегати/фрагменти.
- Пик, който се елуира по-късно, показва разграждане на фрагменти с ниско-молекулно-тегло.
- Липсата на характерен основен пик показва HCP примесни протеини.
Този метод може да осигури количествени данни и може да бъде включен в доклади за разследване на отклонения в процеса; той има високо приемане в материалите за клинично подаване.

4. HCP тестване на ELISA комплект-клетъчен протеин на гостоприемник
Ако в пермеата се открие протеин, резултатът от ELISA е повишен и HPSEC не показва характерен пик на mAb, изтеклият материал може да се определи като протеини на -клетка гостоприемник CHO. Това показва непълно отстраняване на примеси по време на пречистване нагоре по веригата; примесите се отмиват по време на UF/DF етапа и не представляват загуба на продукт.

5. Проверка на афинитетна хроматография (протеин А хроматография)
Протеин А специфично се свързва с Fc областта на mAbs. Заредете пробата от пермеат в колоната: появата на характерен пик на елуиране показва наличието на непокътнато целево антитяло; липсата на пик на елуиране показва, че всички протеини в пермеата са протеини с примеси.

6. Масспектрометрия (LC-MS) (-проследяемост в дълбочина; използва се за изследване на големи отклонения в процеса)
LC-MS може директно да анализира аминокиселинната последователност и да определи точно произхода на протеина. Използва се главно за изследване на трудни или необичайни отклонения и не се използва като рутина в-тест за контрол на процеса.

V. Коригиращи действия, съответстващи на различни аналитични резултати

1. Интактно целево mAb, открито в пермеата
Намаляване на трансмембранното налягане и крайната концентрация след концентрация; стесняване на работния диапазон на процеса въз основа на резултатите от DOE; и проверете целостта на мембранната касета.

2. Фрагменти от разграждане на антитела, открити в пермеата
Изследвайте напрежението на срязване през целия процес и крайните стойности на рН; оптимизирайте етапа на инактивиране на вируса нагоре по веригата, за да намалите разцепването на протеини.

3. Само HCP примесни протеини, открити в пермеата
Не е необходима настройка на UF/DF параметрите. Проследете проблема обратно към предходните стъпки на хроматография и подобрете отстраняването на примеси по време на афинитетна и йонообменна хроматография.

 

VI. Резюме

За да се предотврати изтичането на протеин по време на UF/DF, традиционният контрол на процеса разчита на историческия опит за определяне на индивидуални точкови параметри, които могат да се справят адекватно само със стабилно производство в малък-мащаб. За да се осигури стабилна производителност по време на поетапно мащабиране-нагоре, трябва да се използва характеризиране на процеса, базирано на DOE-, за да се създаде пространство за проектиране на процес с достатъчна толерантност. Базираният на интервал-контрол на параметрите може да компенсира променливостта на производството. След като протеинът бъде открит в пермеата, проста система за UV откриване може да предостави първоначално предупреждение, последвано от електрофореза, HPSEC и ELISA за проследяване и идентификация. Това позволява точно разграничаване между целевия продукт и примесите-в клетката гостоприемник, позволявайки насочено изследване на първопричината и коригиращи действия. Това също е стандартизиран изследователски компонент, който понастоящем е включен в документацията на CMC за mAb проекти.