Пълен анализ на процеса на производство на MRNA лекарства: Как технологията TFF решава предизвикателствата на пречистването
През последните години mRNA технологията постигна пробив в биофармацевтичната област, демонстрирайки огромен потенциал за приложение, особено във ваксини и генна терапия. Успешното разработване на иРНК ваксини не само предостави нови решения за превенция и контрол на инфекциозни заболявания, но също така доведе до напредък в имунотерапията на рака и персонализираната медицина. Като нов клас терапевтични продукти, широко{2}}мащабното производство на иРНК е голямо предизвикателство, включващо контрол на стабилността на РНК, премахване на остатъчни ензими и реакционни-продукти, обмен на буфер и постигане на високи-степени на възстановяване на чистота, всички от които изискват производствени технологии с регулаторно-одобрени решения.
Производственият процес на иРНК ваксини или терапевтици се разделя основно на три етапа: приготвяне на насипен разтвор на плазмидна ДНК, приготвяне на насипен разтвор на иРНК и приготвяне на лекарствен продукт на иРНК-LNP.
Блок-схема на процеса на производство на лекарства на иРНК
Филтрирането на тангенциален поток (TFF), като-утвърдена технология за мембранно разделяне, се прилага широко в производството на иРНК поради своята високо{1}}ефективна способност за молекулярно пресяване, контролируем обмен на буфер и характеристики на ниско напрежение на срязване. Въз основа на дизайна на мембранния модул, обичайните конфигурации на TFF включват плоски-листови касети и модули с кухи-влакна. В допълнение, воденото от налягане{6}} мембранно разделяне в TFF може да се класифицира на микрофилтрация (MF), ултрафилтрация (UF), нанофилтрация (NF) и обратна осмоза (RO) според размера на мембранните пори, с прогресивно нарастваща селективност.
TFF играе критична роля в множество етапи от производството на mRNA лекарства, включително подготовката на плазмидна ДНК в насипно състояние, mRNA в насипно състояние и крайната формулировка на mRNA-LNP лекарствени продукти. Чрез подходящ избор на тип мембрана, намаляване на молекулното{1}}тегло (MWCO) и мембранен материал, TFF позволява ефективно отстраняване на реакционните странични-продукти и примеси с ниско-молекулно-тегло, като същевременно улеснява обмена на буфер и концентрацията както преди, така и след LNP капсулирането. Това значително подобрява чистотата на РНК, стабилността и цялостната скалируемост на процеса.
В допълнение, производителността на тангенциалната филтрация на потока се влияе от фактори за конфигурация на системата, като тип помпа и дизайн на тръбите, както и ключови параметри на процеса, включително трансмембранно налягане (TMP), напрежение на срязване и филтрационен поток. Тези фактори трябва да бъдат внимателно подбрани и оптимизирани въз основа на характеристиките на целевия продукт, особено за чувствителни-на стрес продукти като mRNA–LNP, които са силно податливи на външни механични сили по време на обработка.
Пречистване на плазмидна ДНК
Приготвянето на изходен разтвор на плазмидна ДНК се основава основно на дизайна на последователността на шаблона за транскрипция. Методите за приготвяне обикновено включват плазмидна ДНК амплификация, въпреки че може да се използва и PCR амплификация. Вземайки ДНК амплификация като пример, инженерствоE. coliобикновено се използва за усилване-базирано на ферментация. Процесът на пречистване надолу по веригата включва главно събиране на клетки, лизис и избистряне, концентрация и обмен на буфер, стерилна филтрация, линеаризация и хроматографско пречистване. В промишлени условия центрофугирането с непрекъснат -поток често се използва за събиране на клетки, но то генерира относително високи сили на срязване. Системите с кухи влакна, с техните отворени канали и ниско срязване, са по-подходящи за работа с проби с високо твърдо съдържание, висок вискозитет или чувствителност на срязване, като плазмидна ДНК. След събирането клетките се подлагат на хомогенизиране под високо-налягане, ултразвук или алкален лизис, последвано от предварително избистряне чрез дълбочинна филтрация.
За да се улесни последващата хроматография, често първо се използва филтриране на тангенциален поток (TFF), използващо мембранни касети или колони с кухи влакна с гранични стойности на молекулното тегло от 30 kDa, 100 kDa или 300 kDa, за концентрация и обмен на буфер. Това намалява обема на пробата, като същевременно премахва някои примеси като РНК, протеини на клетката гостоприемник (HCP) и ДНК фрагменти на клетката гостоприемник (HCD). Хроматографията служи като етап на пречистване на ядрото. Обикновено анионообменната хроматография (AEX) се комбинира с хроматография с хидрофобно взаимодействие (HIC) за ефективно отстраняване на примесите и обогатяване на силно биоактивна суперспирална плазмидна ДНК, като по този начин значително подобрява чистотата на плазмида.
След пречистване плазмидът отново се подлага на TFF, за да се концентрира разтворът до целевата концентрация (обикновено 0,5–2 mg/mL) и да се извърши диализа с окончателния буфер за съхранение. Тази стъпка премахва остатъчните соли и органични разтворители от процеса, като гарантира, че буферната система отговаря на изискванията за in vitro транскрипционни (IVT) реакции надолу по веригата.
Пречистване на in vitro транскрибирана (IVT) иРНК
In vitro транскрипцията (IVT) и модификацията са ключовите процеси за приготвяне на изходни разтвори на иРНК. По време на производството на иРНК на IVT се използва комбинация от тангенциална поточна филтрация (TFF1) – хроматография – тангенциална поточна филтрация (TFF2). Тази стратегия гарантира ефективно и високо{4}}качествено пречистване на иРНК, осигурявайки критична подкрепа за производството на ваксини.
След завършване на реакциите на транскрипция и модификация обикновено първо се извършва ултрафилтрация/диафилтрация с помощта на мембранни касети или колони с кухи влакна с молекулно тегло от 30 kDa, 100 kDa или 300 kDa. Тази стъпка ефективно премахва различни примеси,-свързани с процеса, от реакционната система, като РНК полимераза, остатъчни ДНК фрагменти, нереагирали NTP, затварящи ензими, двойно-верижна РНК (dsRNA) и инхибитори на малки-молекули, като едновременно с това се постига обмен на буфер. След една стъпка на тангенциално филтриране на потока повечето примеси се отстраняват ефективно и единственият откриваем остатъчен протеинов примес е РНК полимеразата.
Впоследствие се прилагат множество хроматографски техники за по-нататъшно пречистване. Често използваните методи включват афинитетна хроматография, хроматография с изключване по размер-, хроматография с обратна-фаза на йон-двойки и йонообменна-хроматография. Чрез тази комбинация от ултрафилтрация и последователна хроматография иРНК постига високо ниво на чистота.
За да се изпълнят изискванията за формулиране или съхранение, изходният разтвор на иРНК отново се концентрира или разрежда с помощта на 30 kDa, 100 kDa или 300 kDa мембранни касети или колони с кухи влакна за прецизно регулиране на целевата концентрация и обмен в окончателния буфер на формулировката. Накрая се прилага стерилна-филтрация за контрол на микробното натоварване, завършвайки временното съхранение и пълнене на материала.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
Пречистване на mRNA-LNP състави
Липидните наночастици (LNPs) в момента са най-широко проучената система за доставяне на mRNA терапевтици. Понастоящем различни състави на иРНК-LNP са в различни етапи на предклинично и клинично развитие. LNP са силно чувствителни към производствените процеси. Сред отделните операции, необходими за производството на mRNA-LNP, концентрацията и обменът на буфер чрез тангенциална филтрация на потока (TFF), както и стерилна филтрация, представляват значителни предизвикателства. Тези стъпки трябва да бъдат внимателно оптимизирани, за да се гарантира мащабируемост на процеса и качество на продукта, като същевременно се избягват проблеми като замърсяване на мембраната и неправилно зареждане на филтъра.
След капсулиране на иРНК, за пречистване се използва тангенциална поточна филтрация (TFF). Целта на тази стъпка е да се отстранят некапсулирана иРНК, свободни полимери или липидни материали, както и остатъчни разтворители от иРНК и липиди. Тъй като mRNA-LNPs показват ограничена стабилност при стайна температура, оптимизирането на процесите надолу по веригата, включително TFF, е от решаващо значение за поддържане на качеството на продукта.
Ключовите насоки за оптимизиране включват: подходящо настройване на трансмембранното налягане (TMP) и скоростта на тангенциалния поток въз основа на размера на частиците и стабилността на mRNA-LNPs за балансиране на ефективността на филтриране и напрежението на частиците; избиране на мембрани или колони с кухи влакна с подходящи намаления-на молекулно тегло (MWCO, напр. 100 kDa или 300 kDa) за ефективно отстраняване на свободна иРНК, примеси и обменен буфер, като същевременно минимизира адсорбцията или увреждането на частиците; и оптимизиране на концентрацията и обемите на диафилтрация, за да се осигури ефективен буферен обмен в целевата формула и да се контролира крайната концентрация и дисперсност на частиците.
Освен това критичните качествени атрибути (като размер на частиците, индекс на полидисперсност [PDI] и ефективност на капсулиране на иРНК) трябва да се наблюдават внимателно по време на процеса, а параметрите да се коригират динамично въз основа на данни в реално-време, за да се постигне стабилно, мащабируемо и ефективно пречистване и формулиране на иРНК-LNP.
В допълнение, поради нестабилността на иРНК-LNPs и техните компоненти при крайни стерилизационни методи, 0,2 µm стерилен -филтър обикновено се използва за отстраняване на бактерии и други микробни замърсители.