Предпазни мерки при използване на ултрафилтрация тръба

(1) Изберете подходящата епруветка за ултрафилтрация. По принцип молекулното тегло, което трябва да се задържи, не трябва да бъде по-голямо от 1 / 3 от молекулното тегло на целевия протеин. Например, ако молекулното тегло на целевия протеин е 35kDa, може да се избере ултрафилтрационната тръба с 10kDa молекулно тегло. Ако молекулното тегло на целевия протеин е около 10kd, може да се използва ултрафилтрация тръба с молекулно тегло 3KD. Внимателно прочетете ръководството с инструкции и обърнете внимание на различния толеранс на ултрафилтрационната мембрана към различни химикали.

(2) Новопокупената ултрафилтрация е суха. Добавете ултрапурна вода преди употреба, а водата напълно ще премине през мембраната. Предварително го охладете в ледена вана или хладилник за няколко минути. След това излейте водата и добавете протеиновия разтвор. Добавената сума не трябва да надвишава бялата линия върху горната част на тръбата. Операцията трябва да е лека. Преди да добавите протеинов разтвор, епруветката за ултрафилтрация трябва да бъде вмъкната върху лед за предварително готвене.

(3) Салдо. Както масата, така и центърът на тежестта трябва да бъдат балансирани. Имайте предвид, че скоростта и ускорението не трябва да бъдат твърде бързи, в противен случай ултрафилтрационната мембрана ще бъде директно повредена. Започнете центробежна ултрафилтрация (центрофуга преохлагване до 4 градуса). След RPM на различни центрофуги се превръща в G, тя е различна. Нагласете ускорението на центрофугата до най-ниската предавка, за да намалите налягането върху мембраната. Имайте предвид, че трябва да изчакате, докато центрофугата достигне целевата скорост, преди да напусне центрофугата, в противен случай, когато има проблем с центрофугата, не можете да се справите с нея в първия път. Посоката на мембраната и въртящият се вал се регулират според инструкциите (при ъгъл въртяща се центрофуга мембраната е перпендикулярна на вала). При практическа употреба скоростта като цяло е по-ниска от тази в ръководството, което може да удължи експлоатационния срок на центробежната тръба.

(4) Когато е концентриран към останалите 1ml, вземете 50ul буферен разтвор и добавете 10ul, за да протече през, за да видите дали става синьо, така че да се прецени дали тръбата за ултрафилтрация изтича протеин. Ако тръбата изтече, изсипете горния слой и поточете през новата тръба и започнете ултрафилтрация. За да прецените точно дали тръбата изтича, центрофугирайте с 5mgml BSA за 10мин, след това поемете потока през, пуснете протеиново лепило или Bradford за грубо измерване и продължете да добавяте останалия протеинов разтвор за концентрация (работете върху лед, за да предотвратите нагряването на протеина) до добавянето на всички концентрирани разтвори. Обърнете внимание на това дали протеин утаяването се случва по време на центрофугиране, което води до запушване на тръби. Ако настъпи утаяване, определете конкретната причина за утаяване, дали концентрацията на протеин е твърде висока или буферът е неподходящ; Първите могат да бъдат решени чрез едновременна ултрафилтрация с множество епруветки за ултрафилтрация, за да се намали концентрацията. Последното е да се променят различни буферни разтвори, докато протеинът не се утаи.

(5) Предишните стъпки се използват за концентриране на протеин. Ако искате да промените буфера, когато общият протеинов разтвор е концентриран до около 1ml, внимателно добавете нов буфер (ултрафилтрация през 0,22um ултрафилтрационна мембрана), а след това се концентрирайте до около 1ml за три последователни пъти. Крайният обем на последната концентрация зависи от необходимата протеинова концентрация, която като цяло не е повече от 500ul, или тя може да бъде концентрирана до по-малко от 200ul. Според концентрацията на обема от поне 10 пъти всеки път, тя може да достигне повече от 1000 пъти три пъти, което може основно да постигне целта за промяна на буфера.