Индустриално-пречистване надолу по веригата на бактериофаги — раздел „Избистряне“ и „ултрафилтрация“
Бактериофагите, известни също като фаги, са вируси, които заразяват бактериите. Един фаг не може да оцелее сам; тя трябва да паразитира в бактерия гостоприемник, за да се възпроизведе, като в крайна сметка причинява лизиране на бактерията. Поради своите уникални свойства, фагите могат да се използват клинично за бактериална идентификация и типизиране, както и за лечение на определени рефрактерни бактериални инфекции.
Това е схематична диаграма на структура на бактериофаг (източник на изображението: интернет).
Изчислено е, че болестите по растенията причиняват повече от 30% от световните загуби на реколта всяка година. Сред различните патогени, бактериалните заболявания са особено трудни за контролиране. Традиционните методи за контрол разчитат главно на антибиотици и агенти на базата на-мед. Въпреки това, прекомерната употреба на антибиотици е довела до все по-тежка антимикробна резистентност, докато дългосрочната-употреба на медни съединения води до натрупване в околната среда, което представлява риск за здравето на хората и животните.
Тъй като бактериофагите имат висока специфичност, те могат селективно да убиват патогенни бактерии, без да навредят на полезните микроби или други клетки гостоприемници. Следователно фагите могат да служат като алтернатива на антибиотиците и мед-агентите. Чрез фаготерапия патогените могат да бъдат ефективно елиминирани, като същевременно се намали употребата на антибиотици и медни съединения.
С непрекъснатия научен и технологичен напредък и по-задълбочени изследвания на бактериофагите, перспективите за използване на фаги за лечение на супербактерии стават все по-обещаващи. В бъдеще се очаква фаготерапията да стане едно от ключовите решения за антибиотичната резистентност. Чрез продължаващи изследвания и проучвания, фаготерапията може да се появи като основна сила в областта на антимикробното лечение, давайки по-голям принос за човешкото здраве.
Но за безопасното и ефективно прилагане на бактериофаги в човешкото тяло-особено чрез интравенозно (IV) инжектиране-остава едно голямо предизвикателство:как да се получат ултра{0}}чисти фагови препарати.
Фаговият лизат е сложна смес, която в допълнение към целевите фаги съдържа основни примеси като: бактерии гостоприемници и техните фрагменти, геномна ДНК и протеини гостоприемници (примеси, свързани с -гостоприемника); ендотоксини като липополизахариди (LPS) (примеси,-свързани с процеса); и примеси,-свързани с продукта, включително празни капсиди и счупени опашки.
Следователно целта на пречистването е не само да се постигне висок фагов титър, но и да се намалят примесите-особено ендотоксини, ДНК на гостоприемника и протеини-до изключително ниски нива, както е посочено от стандартите на фармакопеята.
Стабилният и мащабируем процес на пречистване на фаги обикновено следва общите принципи на обработката надолу по веригата и може да бъде разделен на следните логични стъпки:
Процес на пречистване надолу по веригата на бактериофаги
Избистряне – Отстраняване на макроскопични примеси
В началния етап на пречистване на бактериофаг, основната цел на етапа на избистряне е ефикасно отстраняване на непокътнати бактериални клетки и големи клетъчни остатъци от суровия лизат. Основната цел на тази стъпка е да осигури чисто захранване за хроматографски колони надолу по веригата или мембранни сепарационни модули, минимизирайки натоварването от твърди частици. Това ефективно предотвратява запушването в следващите пречиствателни единици, като гарантира стабилна работа и висока ефективност на процеса през целия работен процес на пречистване.
При традиционните процеси надолу по веригата с бактериофаг, избистрянето обикновено разчита на ниско{0}}скоростно центрофугиране, съчетано с много-етапно дълбочинно филтриране-, което обикновено преминава последователно през 0,8 μm, 0,45 μm и 0,22 μm филтри-за ефективно отстраняване на остатъците и примесите от клетката гостоприемник. Въпреки че е зрял и надежден, този подход включва множество стъпки,-отнема много време и изисква многократни трансфери на материали, оставяйки място за оптимизиране на общия добив и ефективност.
Замяна на много{0}}степенната дълбочинна филтрация с aмикрофилтрационна капсуламоже значително да опрости и интензифицира процеса. По-конкретно, след отстраняване на повечето клетъчни остатъци чрез ни-скоростно центрофугиране, лизатът може да бъде обработен директно отфилтриране на тангенциален поток (TFF)с помощта на микрофилтрационни капсули с определени размери на порите (0,45 μm или 0,22 μm). Това позволява финото отстраняване на примесите от частици и ефективното проникване на целевите фаги в aединична стъпка, като ефективно интегрира традиционните три етапа на филтриране в едно.
Тази иновация не само значително намалява времето за работа и ръчната работа, но също така минимизира загубата на проби и риска от замърсяване, причинени от множество стъпки на филтриране, като по този начин подобрява цялостното възстановяване на фагите. Междувременно операцията на тангенциалния поток смекчава замърсяването на мембраната, подобрява производителността и укрепва устойчивостта на процеса.
Следователно приемането на анинтегрирана стратегия за избистряне, съчетаваща ниско{0}}скоростно центрофугиране и микрофилтрационни капсулипредставлява ефективен подход за подобряване на ефикасността и разходо-ефективността на широко{1}}мащабното производство на бактериофаги. Микрофилтрационните капсули на Guidling Technology обикновено могат да намалят мътността на фуража до по-ниско ниво20 NTU, напълно отговарящи на изискванията на следващите етапи на ултрафилтрация и хроматография.
Улавяне и концентрация – първично пречистване и намаляване на обема
По време наулавяне и концентрацияетап на пречистване на бактериофаг, основната цел е ефективно възстановяване на фагите от големи обеми избистрен лизат, като едновременно с това се постига концентрация на първичния продукт и обмен на буфер. Тази стъпка разчита преди всичко наФилтриране на тангенциален поток (TFF)технология.
Принципът на TFF се крие в използването на ултрафилтрационни мембрани със специфично молекулно тегло (обикновено 100 или 300 kDa). Малки молекулни примеси като остатъчни компоненти на хранителна среда, метаболити и малки протеини избирателно преминават през порите на мембраната, докато фагите се задържат в ретентата порадиефекти на изключване на размера, което позволява ефективното им разделяне и обогатяване.
В рамките на TFF система,режим на ултрафилтрациясе използва за постигане на обемна концентрация, докато преминавате къмрежим на диафилтрацияпозволява обмен на буфер, като по този начин създава подходящи физикохимични условия за последващи стъпки като ензимно третиране.
Тази технология предлага комбинираните предимства нависока ефективност на обработкаиотлична скалируемост, което го прави идеален за широко{0}}производство. Според GuidlingTechnology ултрафилтрационните капсули обикновено постигат aстепен на възстановяване на фаги от 90–95%, в зависимост от конкретния материал, който се обработва.
Дълбоко пречистване – целенасочено премахване на критични примеси
При пречистване с бактериофаг,дълбоко пречистванее ключовата стъпка, която определя качеството на крайния продукт. Основната му цел еспецифично отстраняване на критични примеси, като ендотоксини. ТрадиционенCsCl центрофугиране с градиент на плътност-поради неговата токсичност и липса на скалируемост-е елиминиран от индустриалните процеси. Настоящите подходи се фокусират върхутехнологии,-базирани на хроматография, с иновативна интеграция наензимна предварителна обработка.
Усъвършенствана стратегия за комбиниранеанионобменна хроматография (AEC)спредварителна обработка с алкална фосфатаза (АР).е разработена. Както фагите, така и липополизахаридите (LPS) носят отрицателни заряди, което води до конкуренция за местата на свързване в конвенционалните AEC процеси и причинява ко-отделяне, което намалява ефективността на пречистване. Чрез въвеждане на предварителна обработка на АР преди зареждане с AEC, ензимът специфично премахва фосфатните групи от липид А и основните полизахаридни области на LPS молекулите, като значително намалява техния нетен отрицателен заряд. Това ефективно отслабва техния афинитет към анионобменната среда.
Експерименталните данни показват, че третирането на пробата с20 U/mL APпоследвано от пречистване с помощтамембранни адсорбери или монолитни колони с кватернерен амин (Q) лигандможе да постигне до98,8% отстраняване на ендотоксина, като същевременно поддържа отлични нива на възстановяване на фаги. Този подход успешно разрешава дългогодишния-проблем с ко-адсорбцията на ендотоксин по време на пречистване на фаги
Полиране – окончателно усъвършенстване и формулиране
На финалаетап на полиранена пречистване на бактериофаг, основната цел е да се постигне крайна чистота и готовност на формулировката. Това включва премахване на следи от остатъчни примеси, елиминиране на добавки, въведени по време на процеса (като алкална фосфатаза) и пълна смяна на продукта в буферна система,-съвместима с формулировката.
Това обикновено се постига чрезвторична диафилтрация, доказан и ефикасен метод, който позволява както дълбоко отстраняване на малки{0}}молекулни замърсители, така и задълбочен буферен обмен.
За допълнително подобряване на чистотата на продукта,хроматография на взаимодействие с водородна{0}}връзкаилихроматография със смесен{0}}режим (MMC)може да се въведе като aкрайна стъпка на полиране. Тези техники използват многоизмерни механизми за разделяне за отстраняване на следи от компоненти с физикохимични свойства, подобни на тези на целевия фаг. Резултатът е високо пречистена бактериофагна активна фармацевтична съставка (API), която отговаря на строгите стандарти за качество, изисквани заинжекционни{0}}състави.
Чрез избор на комбинация от микрофилтрационни и ултрафилтрационни мембранни модули с площ на мембраната от 1 m², изчисленият максимален обем бактериофаг, който може да бъде обработен, достига до 100 L. Потокът на микрофилтрационния материал е приблизително 20–50 LMH, а потокът на ултрафилтрационния материал е приблизително 15–30 LMH. В сравнение с традиционните методи за обработка, този подход може ефективно да отговори на изискванията на процеса както за избистряне, така и за ултрафилтрация.
препратки:
Сааведра и др.,Мащабно пречистване на бактериофагни препарати (2025)
Лапрас и др.,Рационализиране на процеса на пречистване на фагова активна фармацевтична съставка (2024)