Литературен дял|Кажете сбогом на сложното пречистване? Новият метод TFF + повърхностно активно вещество подобрява ефективността и намалява разходите при производството на AAV вектор

Генната терапия бързо се развива, но високата му цена остава основна бариера, предотвратяваща по -широк достъп на пациентите. Сред ключовите двигатели на тази цена е сложният производствен процес на векторите Adeno -, свързани с вируса (AAV). Проучване, публикувано в биотехнологиите и биоинженеринга, е разработило нов метод за пречистване, съчетаващ филтриране на тангенциален поток (TFF) с повърхностноактивни вещества, което обещава да опрости процеса на пречистване на AAV и да намали разходите. Нека се задълбочим в това изследване, ръководено от екип от Университета в Токио.

 

1. Изследователски опит: Предизвикателства и текущо състояние на пречистване на AAV

AAV векторите са станали инструменти за доставяне на звезди в генната терапия поради високата си безопасност, ниската имуногенност, способността за заразяване както на разделянето, така и не - разделящи клетки и капацитет за дълга - термин ген експресия. Техният производствен процес обаче е сложен, по -специално етапите на пречистване надолу по веригата, които обикновено включват множество кръгове на центрофугиране и хроматография. Тези методи са време - консумират, труд - интензивен, труден за мащабиране и скъп.

В лабораторен мащаб пречистването често разчита на ултрацентрифугиране на цезиев хлорид или йодиксанол, което е предизвикателство за мащаба за промишлено производство. Афинитетната хроматография все повече се използва, но условията на елуиране на ниско елуиране, които изисква, могат да нарушат вирусната инфекциозност. Следователно, разработването на прост, ефективен, нежен и мащабируем метод за пречистване на AAV е от решаващо значение.

Филтрацията на тангенциалния поток (TFF) е размер - техника за разделяне, често използвана за концентриране и буфер -, обменяща биопродукти. Въпреки това, конвенционалният TFF има ограничена способност да премахва примеси като протеини на клетките на гостоприемника (HCP) и ДНК по време на AAV пречистване, често оставяйки протеиновите агрегати зад себе си.

 

2. Иновативен подход: TFF в комбинация с повърхностноактивни вещества за ефективно пречистване

To overcome the limitations of traditional TFF, researchers Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa, and colleagues at the University of Tokyo devised a clever strategy: using surfactants to inhibit aggregation and interaction of impurity proteins, allowing them to pass through the TFF ultrafiltration membrane (500 kDa molecular weight cutoff) while retaining AAV viral particles (~25 nm с размер).

Те тестваха три вида повърхностноактивни вещества:

• Non - ionic:Octyl глюкозид
• Анион:Натриев дезоксихолат
• Цвитероинионен:Chaps

Проучването установи, че използването на не - йонно повърхностно активно вещество само по себе си е неефективно. Както анионният натриев дезоксихолат, така и zwitterionic Chaps значително засилват отстраняването на остатъчните протеини и те са насочени към различни протеинови популации. В крайна сметка, комбинирането на 0,5% натриев дезоксихолат с 1% ChAPS доведе до забележителни резултати, почти напълно елиминирайки остатъчните гостоприемни протеини. SDS - Анализът на страниците показа само трите ясни AAV капсидни протеинови ленти (VP1/VP2/VP3).

 

Фигура 1. Процес на пречистване на TFF без повърхностноактивни вещества;(A) SDS - страница гел електрофореза; (B) Трансмисионна електронна микроскопия (TEM)

 

Фигура 1. Процес на пречистване на TFF с повърхностноактивни вещества;(A) SDS - страница гел електрофореза; (б) електронна микроскопия на предаване (TEM)

 

3. Резултати от изследванията: висока чистота, активност и безопасност

1. Ефективно премахване на примеси:Новият метод постигна 99,98% отстраняване на HCP и 95% отстраняване на ДНК, като чистотата е сравнима или надвишава тази на афинитетната хроматография.
2. Подобрена инфекциозност:Експериментите in vitro показват, че AAV1 векторите се пречистват, използвайки този метод, заразяват клетките HEK293 по -ефективно от тези, пречистени чрез афинитетна хроматография (24,9% срещу 20,8%), което показва по -добро запазване на вирусна биоактивност.
3. Добра in vivo безопасност:След локално инжектиране на пречистени AAV1 вектори в скелетния мускул на мишката, след две седмици не се наблюдава значително възпаление или увреждане на тъканите, което демонстрира добра in vivo безопасност.
4. Широка приложимост на серотип:Методът успешно пречисти множество серотипове -, включително AAV1, AAV5, AAV8 и AAV9-From супернатанти на клетъчната култура. Въпреки това, за AAV2, който съществува главно в клетъчни лизати с високо натоварване на примеси, е необходима допълнителна оптимизация.

 

4. Обобщение и перспективи

Това проучване разработи прост, бърз (1,5 часа), ефективен и мащабируем нов процес на пречистване на AAV. Чрез комбиниране на натриев дезоксихолат и глави, той успешно се справи с предизвикателството на остатъчната агрегация на протеини по време на пречистване на TFF.

Предимствата на метода включват:

• Избягване на тежки условия с ниско pH, по -добро запазване на вирусната активност
• Намаляване на стъпките на хроматография, опростяване на работния процес и спестяване на време и разходи
• Лесно мащабируем, подходящ за индустриална голяма - производство на скала
• Предоставяне на нова стратегия за пречистване на други биомакромолекули като екзозоми, други вируси и рекомбинантни антитела

Текущите ограничения включват неоптимално възстановяване на вируса и неспособност за отделяне на празни капсиди от пълни вирусни частици, което предполага, че най -доброто му използване може да бъде като първо - стъпка заснемане в мулти - стъпка за пречистване на стъпката.

В заключение, това изследване предлага атрактивна нова опция за производството на AAV на AAV надолу по веригата и има потенциал да намали значително цената на лекарствата за генна терапия, улеснявайки тяхното по -широко приложение.