Резюме:

Тази статия разглежда два ключови фактора, които трябва да бъдат взети предвид в стратегиите за пречистване на протеини: изискванията за приложение надолу по веригата и биологичните характеристики на самите протеини. Статията подчертава, че висококачественото пречистване на протеини е основата за надеждността и повторяемостта на експерименталните данни, особено за производството на рекомбинантни протеини. Различните сценарии на приложение имат специфични изисквания за чистота на протеините, активността или съдържанието на ендотоксин, а характеристиките на протеините могат да повлияят значително на стратегиите за пречистване. Според конкретни случаи, статията илюстрира, че уникалните протеини трябва да приемат персонализирани схеми за пречистване. И накрая, беше предложен систематичен процес на производство на протеин (Фигура 1), като се подчертава контролът на качеството на пълния процес от подбора на системите за експресия, конструкцията на конструкцията до оптимизиране на пречистване и препоръчване на оценката на хомогенността и функционалността на протеина чрез биофизични техники (като Sec-Mals, DSF и т.н.). Тази статия има за цел да предостави практически насоки за изследователите, като им помага да формулират ефективни и повтарящи се стратегии за пречистване въз основа на характеристиките и изискванията за приложение на целевите протеини, като по този начин повишава качеството и ефективността на научните изследвания.

 

Фигура 1. Схематична диаграма на процеса на производство на протеини

 

Производство на протеини с висока поискване - примери за идентифициране на проблеми, проектиране на стратегия за смекчаване и съответна продукция

 

1. Нуклеинова киселина Свързване към протеин:

При пречистване на протеините, свързващи нуклеинова киселина, са необходими множество стъпки за отстраняване на замърсяване на нуклеиновата киселина. По време на лизис трябва да се добавят нуклеази (като SM нуклеаза (бензоназа®) или DNase или RNase), но свързаните нуклеинови киселини не могат да бъдат отстранени напълно. Заменете етапите на отстраняване на нуклеинова киселина, като утаяване на PEI или стрептомицин сулфат, пречистване на хепарин или йонообменна хроматография. Наличието на нуклеинови киселини се следи от съотношението A26 0 nm\/A28 0 nm през целия процес на пречистване. Ако съотношението е по -ниско от 0,6, това показва, че чистотата на протеина е сравнително висока и замърсяването на нуклеиновата киселина е минимално. За протеини със силно свързани нуклеинови киселини те могат да бъдат временно денатурирани (като лекувани с урея) и след това да се ренатурират. Ключови точки: Използвайте висококачествени реагенти, пресни буфери и чисти колони (чисти с 0,5M NaOH преди употреба).

 

2. Тежка верига на мишката феритин:

Целта на производството на пречистен протеин от тежка верига на миши феритин (MFTH1) е крио-електронна микроскопия с едно частична разделителна способност (Cryo-EM). Експресионният вектор на Escherichia coli, кодиран белязан MFTH1, беше ултразвуково нарушен, без да се добавя нуклеаза. След нагряване при 7 0 градус, той претърпя утаяване на амониев сулфат, стъпки на хроматография на диализа и изключване на размера. Получената проба показа наличието на голямо количество замърсители в крио-електронни микроскопични изображения (Фигура 2А), което е напълно неподходящо за неговото приложение. Оптимизирайте стъпките. Добавете SM нуклеаза по време на процеса на лизис на клетките и диализния процес след утаяване на амониев сулфат и след това добавете стъпката на хроматографията на анионния обмен, за да намалите съотношението A26 0 nm\/A280Nm от 1,4 до 0,8. След хроматография за изключване на размера, съотношението на A260Nm\/A280NM от крайната проба MFTH1 е 0,56. Изображенията на SDS-PAGE и крио-електронна микроскопия (Фигура 2В) показват, че протеинът е много чист, което показва, че замърсителите са били ефективно отстранени.

Фигура 2 Тежка верига на мишката феритин

 

 

 

3. Химерният протеин човешки DSRBEC (DSRBD-EGF-Chimera):

DSRBEC се образува от сливането на двуверижния РНК свързващ домен (DSRBD) на човешкия протеин киназа R и човешкия епидермален фактор на растеж (HEGF). Когато DSRBD се експресира в Escherichia coli, той показва изключително висока способност за свързване на dsRNA. След клетъчния лизис, замърсената РНК ще попречи на свързването на рекомбинантните протеини към колоната с афинитет на афинитета на фиксирания метал (IMAC). Конвенционалните методи като PEI или стрептомицин сулфат утаяване, обработка на РНК или високо съдържание на буферни разтвори не могат да премахнат РНК. Клетъчният лизис се извършва с помощта на буфер, съдържащ 4M урея. Супернатантата се зарежда върху колона IMAC, а 4m до 0 m урея се използва бавно за една нощ (ренотурация на колона). Буферът за ренотурация се добавя с имидазол и се елуира от колоната IMAC. Крайното усъвършенстване се провежда чрез гел филтрация на Superdex 75, за да се получи функционално активен DSRBEC.

 

4. Протеини, свързани с двувалентни катиони или други кофактори:

За протеини, които взаимодействат с двувалентни катиони като Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ или други кофактори, е от решаващо значение да се добавят специфични двувалентни катиони (или други кофактори) по време на експресията. По време на процеса на пречистване е необходимо и малко количество от същите двувалентни катиони (или други кофактори). Трябва да се избягва използването на всички хелативни агенти (като EDTA, EGTA) и хелативни редуциращи агенти (като DTT или DTE). При работа с протеини, свързани с двувалентни катиони, трябва да се използва смес от протеазни инхибитори без хелативни средства за потвърждаване на действителното присъствие на двувалентни катиони (или други кофактори) в пречистения протеин чрез спектроскопски методи (като атомна абсорбционна спектрофотометрия).

 

5. Рекомбинантен феридоксин (RFD), съдържащ единичен [2Fe ± 2S] клъстер от термофилен цианобактерия мастигокладус ламинозус

Феридоксинът е разтворим железен сулфурен протеин, който участва в реакции на трансфер на електрон. Фероредоредоксин от растителен тип носи един [2Fe ± 2S] клъстер като електронен акцептор на фотосистема I. щамът Escherichia coli BL21 (DE3) експресира рекомбинантния RFD протеин в TB среда, съдържаща 10 mm Fecl3 и антибиотици. Елуирането на колоната за улавяне на iMac се извършва с помощта на буфер, съдържащ 10 мм хистидин, за да се избегне имидазол и да се предотврати унищожаването на [2Fe ± 2S] клъстера. Анионният обмен и хроматография за изключване на размера бяха използвани за по -нататъшно пречистване и концентрация до 12 mg\/ml за скрининг на кристализация. В сравнение с рекомбинантното производство на фероредоксин, естественият фероредоксин, пречистен от синьо-зеления водораслен мастигокладус ламиноз, постигна по-висока разделителна способност по време на кристализация.

 

6. Протеини, използвани като антигени

Протеините често се използват като антигени за възстановяване на специфични за целта лиганди. Първото нещо, което трябва да се вземе предвид, е дали протеинът се използва за in vivo имунитет за получаване на конвенционален моноклонален или поликлонален IgG, или за програми, включващи камилни IgG или in vitro процеси на подбор.

 

6.1 Антигени, използвани за рутинно производство на антитела

Когато антигените се използват за получаване на моноклонални IgG антитела, правилното сгъване на антигена обикновено не е необходимо, тъй като повечето моноклонални антитела разпознават линейни епитопи, които не са силно повлияни от структурата на антигена, и дори денатурирани антигени (като протеини за включване на тялото) остават ефективни. Въпреки това, чистотата трябва да бъде строго контролирана, за да се избегнат силни имуногенни замърсители, пречат на имунния отговор и да причинят доминиране на нецелеви антитела.

 

6.2 Скрининг на библиотеката на конюгата

Трябва да се обърне специално внимание на поддържането на естествената конформация на антигена по време на обработката на библиотеката на нанободи, получена чрез имунизация на камилите. За разлика от конвенционалните антитела, камилските антитела (особено наномодиите) са склонни да разпознават структурни епитопи, което е свързано с тяхната уникална изпъкнала структура на площадката. По същия начин, когато екранизира големи синтетични или естествени библиотеки на антитела in vitro, антигенът трябва да поддържа структура, която е напълно съвместима с целевото приложение. Тъй като самият процес на скрининг е не пристрастен, ако антигенът има неправилно сгъване, агрегиране или конформационна хетерогенност, може да се прегледа голям брой конюгати, насочени към неестествени епитопи.

 

 

 

7. Протеини, съдържащи междумолекулни или вътремолекулни дисулфидни връзки или свободен цистеин

Дисулфидните връзки са от решаващо значение за стабилизиране на естествената структура на протеините. По време на процеса на пречистване, когато пречиствате протеини, съдържащи междумолекулни или вътремолекулни дисулфидни връзки, е необходимо да се избегне добавяне на редуциращи агенти, за да се предотвратят конформационните промени на протеините, като по този начин се променят техните функции. За протеини, съдържащи свободен цистеин, редуциращите агенти са необходими на всички етапи на процеса на пречистване, особено по време на съхранение, за да се предотврати образуването на изкуствени дисулфидни връзки. Най -често използваните редуциращи средства са дитиотреитол (DTT), -меркаптоетанол (-me) и Tris (2- карбоксиетил) фосфин хидрохлорид (TCEP). За IMAC смоли, които са несъвместими с DTT или TCEP, се препоръчва да се използват -me и да ги заменяте с други редуциращи агенти в следващите стъпки.

 

8. Фрагмент на рекомбинантно антитяло

Въпреки че структурата на рекомбинантните фрагменти на антитела (като наномодии) е по -проста от тази на IgG, тяхната функция зависи от правилното образуване на дисулфидни връзки. В бактериалните експресионни системи, дори при приемането на стратегии за оптимизация, все още могат да се появят неправилно сгънати или частично сгънати продукти, които съществуват както в разтворимата част, така и в тялото на включване. По -прикрито е, че дори правилно сгънатите фрагменти на антитела могат да образуват разтворими агрегати (колоидна агрегация) чрез хидрофобни плаки на повърхността. Такива агрегати са трудни за идентифициране в рутинни функционални тестове (като ELISA), тъй като многовалентното свързване може да маскира спада на афинитета на мономер, но тяхното присъствие може сериозно да повлияе на приложения, които разчитат на размера на малки молекули (като супер разделителна способност). Следователно, разчитането само на SDS-PAGE е недостатъчно за оценка на качеството на извадката. Биофизичните методи като гел филтрация (Фигура 3) трябва да бъдат приети за разграничаване на мономери (основни пикове) от агрегати (върхове на обем на изключване). Ключовите контролни точки включват: Оптимизиране на редоксната среда по време на изразяване за насърчаване на образуването на дисулфидна връзка и оптимизиране на условията за съхранение след пречистване за предотвратяване на агрегиране. Тези мерки са от решаващо значение за гарантиране на монодисперството и функцията на фрагментите на антителата.

Фигура 3. Разделяне на филтрация на гел на разтворими агрегати на наносъди

 

9. Разтворими фрагменти от лимфоцитен рецептор LLT1

Рекомбинантната експресия на дисулфидни връзки-зависими протеини (като лимфоцитен рецептор LLT1) често е изправена пред затруднения с сгъване. Гел филтрацията на див тип LLT1 показва пикове на агрегиране и пикове на димер (Фигура 4А), но масспектрометрията разкрива неправилно сгъване, причинено от неспарен цистеин в димера (Фигура 4В). За тази цел са проектирани два мутанта: един премахна проблема цистеин, което води до внезапен спад на добива (Фигура 4А); След въвеждането на неоцистеин за реконструкция на съответната дисулфидна връзка, мутантът не само имаше висок добив и добра стабилност, но и може да кристализира (Фигура 4С), а 3D структурата потвърждава, че мутантът образува правилната дисулфидна връзка и поддържа естественото сгъване. Този случай показва, че чрез рационално проектиране на конформални дисулфидни връзки, комбинирани с филтрация на гел и анализ на масспектрометрията, проблемът с сгъването на рекомбинантните протеини може да бъде ефективно решен и могат да се получат функционални протеини със стабилни структури и високи добиви.

Фигура 4. Реконструкцията на дисулфидната връзка подобрява сгъването и добива на разтворим LLT1

 

 

 

10. Лесно агрегиращи се протеини

Пречистването на рекомбинантните протеини често е изправено пред проблема с агрегацията и неговото образуване следва механизма за растеж на нуклеацията-малко количество разтворими агрегати се образуват първо и след това задействат мащабно неразтворима агрегация. To address this challenge, multi-level strategies need to be adopted: At the expression stage, this can be achieved by optimizing the strain, reducing the culture temperature, using modified culture media or different solubilizing fusion proteins, and replacing expression systems (insect\/mammalian cells), etc. During the purification stage, rapid operation (in a 4 degree C environment) is required to avoid excessive protein concentration, and a "rapid purification strategy" (such as direct connection of IMAC до sec) трябва да бъде приет, за да се премахне незабавно агрегираните ядра. Най -общо казано, когато скрининговите буферни разтвори трябва да се вземат предвид фактори като състав на компонента, рН стойност, дисоциализиращ агент или разтворител (Фигура 5). Чрез фина оптимизация на ортогоналното откриване (като SEC, CD, LS, DSF и температурно изместване на базата на флуоресцентна топлина и др.), Качеството на протеина и най -подходящият буферен разтвор са определени.

Фигура 5. Стратегии за облекчаване на агрегацията на протеини

 

11. Кристализация на човешката CLK1 киназа (как да се получат възпроизводими партиди)

За да се получи хомогенна нефосфорилирана CLK1 киназа за изследвания на кристализация, беше приета схема за сътрудничество с много стратегии. Първо, той е експресиран съвместно с λ -фосфатаза в Escherichia coli, за да се елиминира хетерогенността на автофосфорилирането. Въпреки че добивът е намален, беше осигурено цялостно дефосфорилиране. След улавяне от iMac, елуентът се допълва със стабилизатори (50 мм аргинин, 50 мм глутаминова киселина и 10 мм DTT), за да се предотврати агрегацията, концентрира се и неговият маркер се отстранява чрез храносмилането на TEV. След това правилният олигомер се разделя с SEC (съдържащ 5% глицерол и -me). Крайният важен етап на анионния обмен прави разлика между кристални (нефосфорилирани) и некристални (частично фосфорилирани) групи CLK1. Особено си струва да се отбележи, че начинът на клетъчен лизис влияе значително на стабилността на протеина-методът с високо налягане и високотемпературата води до необратимо агрегиране на CLK1, подчертавайки значението на леко лечение за подготовка на киназа.

 

 

 

12. Произвеждайте галектин -1 със стабилна лиганд-свързваща способност

За да се подготвят функционален галектин -1 за изследвания на свързване на лиганда, стратегиите за изразяване и пречистване на четири конструкции (белязан и негов белязан от див тип галектин -1, белязан и негов белязан мутан мутан мутант Galectin -1) бяха сравнени. Ключовите находки показват, че пречистването на хроматографията на афинитета на лактоза може ефективно да екранизира за правилно сгънати протеини, но трябва да се комбинира с старателна диализа (Hepes буфер), за да се отстрани напълно лактозата от мястото на свързване и да възстанови активността на CRD. Галектин от див тип -1 е предразположен към окисляване и инактивиране и стабилността му остава ограничена дори при наличие на редуциращи агенти (Фигура 6). Въпреки това, мутантът без цистеин значително засилва дългосрочната стабилност, като същевременно поддържа сравнима активност на аглутинация и термична стабилност (потвърдена от Nanodsf, ITC и т.н.) чрез елиминиране на зависимостта на дисулфидната връзка.

Фигура 6. Хидродинамичната характеристика на рекомбинантния галектин -1 разкрива неговата нестабилност

 

13. Отстраняване на ендотоксин

Методът за отстраняване на ендотоксин се основава на афинитетна хроматография, включително положително заредена хроматография (анионен обмен), използването на поликационни лиганди (като поли-L-лизин (PLL), имобилизиран полиамин (полимиксин В)) и добавяне на повърхностния тритон X {2}}. По време на процеса на пречистване обърнете внимание на подготовката на буферния разтвор с вода без LPS и използвайте нови колони или колони, които са били използвани само в други пречиствания без LPS. За замърсяване на ендотоксин хроматографската помпа\/течност може да се инкубира за една нощ в 0. 5m NaOH или в продължение на 4 часа в 1. 0 M Naoh. Окончателното количество LPS в пробата се оценява с помощта на Limulus Amebocyte Lysate реагент (LAL) и беше проверено дали е под ограничението, необходим за конкретното приложение.

 

14. Протеинов комплекс

Експресията и пречистването на протеиновите комплекси трябва да бъдат оптимизирани според специфични условия. Предизвикателствата включват нестабилността или неправилното сгъване на субединици. Всяка субединица може да бъде експресирана независимо и сглобена in vitro или съвместно експресирана, за да образува функционални протеинови комплекси. Конструкцията на конструкцията трябва да бъде внимателно въведена с етикети за пречистване или откриване, за да се избегне намеса в сглобяването, особено когато сложната информация е ограничена и са необходими множество оптимизации. По време на процеса на пречистване целостта и стабилността на комплекса трябва да бъдат оценени. Методите включват SDS-PAGE (откриване на субединица), SEC (хомогенност), SEC-MALS (анализ на моларна маса), масова фотометрия или естествена мас-спектрометрия (проверка на масата). Трябва да се отбележи, че комплексът може да се дисоциира при ниски концентрации. Понастоящем трябва да се оптимизира хроматографският метод или буфер (като чрез термичен дрейф или DSF скринингови условия). Освен това, намаляването на етапите на пречистване може да предотврати загубата на слабо взаимодействие субединици и да балансира ефективността на пречистване и целостта на комплекса.

 

 

 

15. Пречистване на антиген-антитяло комплекси

Антитяло-антигенните комплекси са типични примери за протеинови комплекси. Тяхната съвместна кристализация може да разкрие модели на свързване и да ръководи оптимизирането на инженерството на антителата. Традиционните методи изискват отделно пречистване на антигени и антитела и след това ги смесват. Последните проучвания обаче показват, че стратегиите за съвместна експресия и съвместно-пречистване са по-ефективни. Необходимо е само едно пречистване за получаване на комплекса и в същото време нестабилните антигени могат да бъдат стабилизирани чрез антитела и дори да се постигне експресия без етикети. В тази специфична ситуация обикновено са достатъчни филтрацията на SDS-PAGE и гел (SEC), за да се оцени чистотата и качеството на комплекса.

 

Резюме

Пречистването на протеини е основна технология в научните изследвания. Производството на академичен мащаб на протеини обикновено следва стандартни стратегии и може да произвежда високо чистота на милиграм, разтворими протеини, които се използват широко в структурната биология, биохимията и функционалните изследвания. Въпреки това, специалните изисквания на приложенията надолу по веригата (като необходимостта от никаква ендотоксин в експериментите с животни и няма замърсяване с нуклеаза при изследване на нуклеиновата киселина) или присъщите характеристики на протеините (като лесна агрегация, съдържащи дисулфидни връзки или афинитет на високата нуклеинова киселина) често изискват персонализирани разтвори. Този преглед, в отговор на тези специални обстоятелства, предлага усъвършенствани стратегии, вариращи от избора на системи за изразяване, проектирането на конструкции (оптимизиране на етикетите и границите на домейни) до процеса на пречистване и въвежда контрол на качеството (като SEC, SDS-PAGE, откриване на дейности и т.н.) на ключови стъпки. Някои приложения също изискват допълнителен анализ (като откриване на ендотоксин и определяне на остатъците от нуклеинова киселина), подобно на концепцията за „осигуряване на качеството“ (QA) в биофармацевтичната индустрия, тоест за предотвратяване на дефекти чрез систематични процеси. Чрез формулиране на насоки за контрол на качеството и изясняване на специфични стандарти за протеинови реагенти, използвани в научните изследвания, целта е да се установят по -строги норми за пречистване на протеини за академичните лаборатории, да се подобри надеждността и повторяемостта на експерименталните данни и да се преодолее разликата между основните изследователски и индустриалните стандарти.

 

Doi: 10.1186\/s 12934-022-01778-5