Мембранна технология и изясняване на ваксината (Ⅰ)
Ваксините идват от различни източници, включително тъканни екстракти, бактериални клетки, вирусни частици, протеини и нуклеинови киселини, произведени от рекомбинантни клетки на бозайници, клетки от дрожди и насекоми.
Най-често срещаният метод за производство на ваксина се основава на първоначален процес на ферментация, последван от пречистване. Производството на ваксини е сложен процес, който включва много различни стъпки и процеси. Изборът на правилния метод за пречистване е от решаващо значение за постигане на желаната чистота на крайния продукт. Избистрянето на ваксините е важна стъпка, която има значително въздействие върху възстановяването на продукта и последващото пречистване надолу по веригата. Могат да се използват няколко техники за изясняване на ваксините. Изборът на метод за събиране и оборудване зависи от вида на батерията, естеството на продукта, който се събира, и технологичната течност. Тези техники включват мембранна филтрация (микрофилтрация, филтрация с тангенциален поток), центрофугиране и дълбока филтрация (филтрация с нормален поток). От дългогодишен опит избистрянето на реколтата от ваксината обикновено се постига чрез центрофугиране, последвано от дълбоко филтриране.
През последните години техниките, базирани на мембрани, добиха известност в изясняването на ваксината. Процесите нагоре по веригата все повече използват технологии за еднократна употреба, така че стратегиите за събиране на реколтата трябва да се променят. Тази статия предоставя изчерпателен преглед на различни мембранни технологии и техните приложения при избистряне на ваксини.
01 Въведение
Ваксините са критичен компонент от нашата превенция на инфекциозни заболявания, които остават шокираща причина за смърт. Между 2 и 3 милиона души се спасяват от дифтерия, тетанус, магарешка кашлица и морбили всяка година благодарение на имунизацията. Ваксините покриват широк диапазон, от малки рекомбинантни протеини до цели вирусни частици и цели бактерии. Те могат да бъдат произведени от различни системи: яйца, клетки на бозайници, бактерии и др. Поради сложността и разнообразието на ваксините, в момента няма основен протокол за пречистване или шаблон, въпреки нарастващия интерес към платформите за ваксини.
Обикновено процесът на ваксина може да бъде разделен на три части: нагоре по веригата (производство и избистряне), обработка надолу по веригата (пречистване, включително ултрафилтрация, хроматография и химическа обработка) и формулиране (операции за окончателно пълнене). Независимо от производствената система, избистрянето (първоначалното отстраняване на нежелани вещества) играе ключова роля при определянето на стабилен процес на пречистване. Правилната стъпка на избистряне основно премахва цели клетки, клетъчни остатъци, колоиди и големи агрегати, за да намали тежестта на обработката надолу по веригата. В някои случаи избистрянето може също да намали неразтворимите примеси, протеините на клетката гостоприемник (HCP) и нуклеиновите киселини на клетката гостоприемник. Както всеки друг етап на пречистване, етапът на избистряне трябва да бъде оптимизиран, за да се постигне максимален добив и чистота на продукта, като същевременно се адаптира към спецификата и производствените ограничения на ваксината.
Поради хетерогенността на типовете ваксини, се използват различни техники за избистряне, включително центрофугиране или филтруване (Таблица 1).
Обикновено са необходими няколко серии от операции, за да се постигне желаното избистряне. Първата операция е предназначена за отстраняване на по-големи частици (първично избистряне), а втората операция е предназначена за отстраняване на колоиди и други субмикронни частици (вторично избистряне). Нискоскоростното центрофугиране служи като еднократна опция за избистряне, което позволява на клетките и клетъчните остатъци да бъдат отстранени чрез утаяване. Центрофугирането може да се справи с високи твърди товари и е широко използвано в партиден или непрекъснат режим и дискови центрофуги. Той изисква високи капиталови инвестиции и разходи за поддръжка и е изправен пред предизвикателства при разширяването поради липсата на надежден модел за намаляване на мащаба. Някои търговски производители на ваксини обаче използват центрофуги в широкомащабно производство, включващо големи обеми на обработка и повече производствени дейности.
Филтрирането с избистряне може да се извърши чрез филтриране с нормален поток (NFF, известно още като филтриране в задънена улица) или филтриране с тангенциален поток (TFF, известно също като филтриране с кръстосан поток). Има и специфични режими на филтриране (дълбоки филтри), които съдържат положително заредени материали и филтриращи СПИН, които подобряват задържането на клетъчни остатъци, колоиди и отрицателно заредени нежелани компоненти.
Мембранните филтри задържат частици чрез изключване на размера и нямат висок капацитет за задържане на мръсотия, така че са подходящи за етапи на вторично избистряне. Както дълбоките филтри, така и мембранните филтри са лесни за мащабиране и внедряване (прост дизайн на системата). За разлика от NFF, TFF се използва главно за първично избистряне (микрофилтрация). Мембрани с граничен диапазон от 0.1-0.65 μm (за предпочитане с отворен канал) са успешно използвани за задържане на клетки, клетъчни остатъци и други големи замърсители. Повечето TFF оборудване са линейно мащабируеми и могат да се използват повторно след почистване, което значително намалява разходите за консумативи за стъпката.
Стъпката на избистряне се намира между процесите нагоре и надолу по веригата и понякога се пренебрегва по време на разработването на процеса на ваксина, тъй като времето и ресурсите са приоритетни за други стъпки на пречистване, като хроматография или центрофугиране с градиент на плътност.
Дори патентите за процесите на производство на ваксини често пропускат стъпката на изясняване. Ефективността на избистряне пряко влияе върху производителността на процеса надолу по веригата. Лошо оптимизирана стъпка на избистряне може да повлияе отрицателно на капацитета на стерилизирания филтър или да съкрати експлоатационния живот на хроматографската смола. Днес по-строгите регулаторни очаквания карат производителите на ваксини да произвеждат по-чисти, добре охарактеризирани, но достъпни ваксини. В този случай на всяка стъпка трябва да се обърне вниманието, което заслужава. Настоящите тенденции предполагат, че процесът нагоре по веригата се движи към "по-чиста" експресионна система (т.е. клетки, култивирани в среда без серум, заместват яйцата) с повишена продуктивност и по-висока клетъчна плътност.
Процесите на пречистване надолу по веригата се опростяват и рационализират, за да се увеличи чистотата на крайния продукт. За да се справи с тези промени, стъпката на изясняване не може да се превърне в пречка. В този случай технологията за филтриране посреща ново предизвикателство за избистряне, адресирайки въпросите за повишена гъвкавост на процеса, възможност за еднократна употреба и намалени инвестиционни разходи.
02 Изясняване на вирусните ваксини
Няколко вида методи за избистряне, самостоятелно или в комбинация, са успешно използвани за избистряне на реколтата в края на захранването на ваксините.
Пилотен мащаб:1-20L, производствен мащаб: повече от 20L
2.1 Предпазни мерки за изясняване на вирусна ваксина
Много ваксини съдържат всички или част от вирусните частици, за да образуват имунитет срещу вирусна инфекция. Те обикновено попадат в четири широки категории:
Жива атенюирана ваксина (LAV), която се основава на отслабен щам на вируса, за да се намали неговата вирулентност. Атенюираните вируси могат да се репликират в тялото, но не са патогенни.
- Инактивирани вирусни (IV) ваксини, които съдържат химически или ултравиолетови инактивирани вируси за елиминиране на инфекциозността. Вирусните частици могат да бъдат пълни, разделени или пречистени (само антигенни протеини).
- Ваксината срещу вирусен вектор (VV) е активен, непатогенен вирус, който представя антигена на патогенен вирус. Тези наскоро разработени структури се използват и за приложения на генна терапия.
Ваксини с вирусоподобни частици (VLPs), специфичен клас ваксини срещу вирусни субединици, които имитират цялостната структура на вирусните частици, но не съдържат инфекциозен генетичен материал.
В повечето случаи вирусните частици са напълно непокътнати по време на етапа на избистряне, дори по време на лизиране на вирусната ваксина (разцепването обикновено се извършва надолу по веригата, в по-пречистена среда).
Основното предизвикателство на вирусното избистряне е възстановяването на вирусни частици с висок добив, като същевременно ефективно премахва клетъчните остатъци, големите агрегати и неразтворимите замърсители. Както е описано в следващите раздели, има няколко фактора, които могат да причинят разграждане или загуба на вируса. Освен това може да бъде трудно да се разчита на вирусния добив поради голямата променливост на методите за количествен анализ на вируса на този етап от процеса, особено за LAV и VV ваксини. За тези ваксини вирусният добив често се оценява с помощта на тестове за инфекциозност като тест за плака или тест TCID 50. Фактът, че някои от събраните съединения могат да попречат на способността на вируса да инфектира индикиращите клетки, увеличава променливостта на този количествен подход.
2.2 Стратегия за изясняване на вирусната ваксина
Вирусните ваксини се различават значително по размер, структура, форма и експресионни системи (Таблица 3).
В резултат на това обикновено няма шаблон за неговите процеси надолу по веригата, особено стъпките за изясняване. На теория всички налични техники (нискоскоростно центрофугиране, микрофилтрация TFF, NFF) могат да бъдат избрани и потенциално комбинирани за изясняване на вируса. Всъщност успехът на методите за избистряне се влияе от експресионната система и физикохимичните свойства на участващите вируси.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} клетки /ml) метод за избистряне, използващ катионни полимери, намалява площта на дълбока филтрация 4 пъти в сравнение с традиционните методи. Тази техника позволява събирането на реколтата от ферментатори с голям капацитет без използването на центрофуги. По подобен начин, Riske et al. показват, че третирането с хитозан на 40 L клетъчни култури (0,02%), съдържащи 1.4-2.6% твърди вещества, води до 7-кратно увеличение на абсолютния филтърен капацитет след дълбоко филтриране.
Те също така споменават, че хитозанът изглежда подобрява ефективността на избистряне чрез флокулиране на субмикронни частици, които обикновено се утаяват в центрофуги. Методите за предварителна обработка и флокулация вероятно ще продължат да бъдат част от бъдещите пояснения за филтриране на ваксини. Проникващите вещества, включително захари, гликоли и аминокиселини, за предпочитане флокулират вируси. Вирусната флокулация с осмотичен разтвор, последвана от 0.2µ микрофилтрация, може да се използва като цялостен процес за пречистване на вируси. Проникващите вещества могат да стимулират вирусната агрегация чрез намаляване на хидратиращия слой около частиците, за да флокулират хидрофобни некапсулирани вирусни частици и капсулирани вирусни частици. Въпреки че е доказано, че пенетрантите флокулират вируси, методът има потенциала да бъде платформа за бъдещо пречистване на ваксини и неговата осъществимост при пилотно или широкомащабно пречистване на ваксини не е доказана. Методът за предварителна обработка с флокулация, който вероятно ще продължи да бъде част от бъдещото избистряне на филтъра за ваксина, се извършва в 2L ферментатор. За да бъдат потенциално използвани в широкомащабни производствени операции, тези методи трябва да бъдат валидирани в пилотни и производствени мащаби.
2.2.1 Изразяване на системното въздействие
Методът на избистряне зависи главно от вида на процеса нагоре по веригата и експресионната система, която определя вида и нивото на замърсителите, които трябва да бъдат отстранени. Вирусните ваксини обикновено се произвеждат в пилешки ембриони от непрекъснати клетъчни линии на бозайници или птици или клетки от бакуловирус/насекоми, които са по-сложна експресионна система. Някои видове VLP могат също да бъдат произведени от други хетероложни експресионни системи (бактерии, дрожди, растителни клетки).
2.2.1.1 Вирус, произведен в пилешки ембрион
Ваксините се произвеждат в яйца от десетилетия. Тази работа датира от 1931 г., когато Woodruff и good Pasture успешно използват хорио-алантоисната мембрана на оплодените яйца като субстрат за вирусен растеж. Днес много човешки и ветеринарни ваксини все още се произвеждат с помощта на този древен процес. Най-известната вероятно е ваксината срещу сезонен грип. Принципът е да се инокулират кокоши яйца с интересни вируси и след това да се репликират в хорио-алантоисната мембрана. След размножаването се събира и пречиства алантоична течност, богата на вирусни частици.
Алантоичната течност е предизвикателна избистряща храна. Високото минерално и протеиново съдържание (включително овалбумин) му придава висок вискозитет. Алантоичната течност също съдържа основни тъканни съединения от пилешки ембриони, като пера, човки, кръвоносни съдове или кръвни клетки. Поради високото съдържание на твърди вещества, нискоскоростното центрофугиране е предпочитаният вариант за първично избистряне, което обикновено води до степен на възстановяване от около 70%. Възможно е обаче и първично избистряне с помощта на техники за филтриране. За NFF дълбоките филтри на базата на полипропилен и целулоза имат добри способности за събиране на алантоична течност. Повърхностните филтри, направени от полипропилен или дълбоки филтри на основата на целулоза, могат да имат капацитет от 150-210 L/m² и да намалят мътността на захранващия поток до 3 пъти. Устройството TFF с отворен захранващ канал също е подходящо за избистряне на алантоична течност, тъй като устройството е по-подходящо за минимална загуба на налягане през захранващия канал, като по този начин се намалява запушването на канала.
Вторичната стъпка на избистряне може лесно да се направи с NFF. Комбинацията от материали от полипропилен, целулоза и стъклени влакна обикновено показва добра ефективност и алтернатива на етапа на вторично избистряне е използването на TFF и {{0}}.65 μm или 0,45 μm микрофилтрационно мембранно устройство и управление на осмотичен поток контрол. В този етап може да се използва TFF устройство с отворен канал с хидрофилна PVDF или хидрофилна PES мембрана.
Важно е да се отбележи, че вирусните частици могат да бъдат свързани с неразтворими отломки, което може значително да намали производството на вируси по време на избистряне. Използването на солен разтвор може да намали тази връзка между грипните вируси и твърдите фрагменти, което води до приблизително двукратно увеличение на производството, без да се засяга целостта на вирусните частици.
2.2.1.2 Вируси, произведени в последователни клетъчни линии на бозайници и птици
Напоследък някои вирусни ваксини се отдалечиха от процеси, базирани на яйца, в полза на процеси, базирани на клетъчни култури (особено за ваксините срещу грип). Основната причина за това преминаване е да се предотвратят проблеми с производството на ваксини, свързани с ембрионални яйца (т.е. недостиг на запаси от яйца, който може да възникне в случай на огнище на болест по домашните птици). В резултат на това в момента се разработват много видове ваксини и вирусни вектори, като се използват непрекъснати клетъчни линии от бозайници или птици, конвенционални клетъчни линии (като клетъчни линии Vero, MDCK или HEK293) или патентовани клетъчни линии.
В зависимост от експресионната система, вирусът може да остане вътре в клетката, което изисква етап на клетъчно лизиране, или може да остане извън клетката (лизиране или пъпкуване). Твърдият товар и разтворимото съдържание, получени от клетъчната култура, са много по-чисти от алантоисната течна фаза. В резултат на това NFF технологията е по-лесна за внедряване и капацитетът е значително по-висок. Капацитетът на филтриране обаче силно зависи от условията на клетъчна култура, като клетъчна плътност или клетъчна жизнеспособност при събиране на реколтата. Тези параметри влияят върху количеството клетъчни остатъци и макроагрегати, които могат да запушат дълбоки филтри и мембрани, което води до намален капацитет.
Thomassen et al предоставят добър пример за изясняване на NFF. Използва се в процеса на производство на инактивиран полиовирус (IPV). Vero клетки, култивирани върху микроносители, се използват за вирусна пролиферация с клетъчна плътност {{0}}.78 x 106 клетки/ml TOI. 75 μm сито от неръждаема стомана се използва за предварително избистряне за отстраняване на микроносители от реколтата. Двуслойното класифициране се избистря с помощта на дълбок филтър за плътност (0.2-2.0μm), последван от филтър със стерилизирана степен.
Избраната мащабируема единица за еднократна употреба беше успешно използвана за приготвянето на материал за клинично изпитване на Sabin IPV в мащаб 350 L. В зависимост от серотипа на вируса се получава процент на възстановяване на вируса от 86 до 96 процента.
2.2.1.3 Бакуловирус/вирусоподобни частици, произведени в клетъчната система на насекомите
Разглеждането на бакуловирусни/клетъчни системи от насекоми за широкомащабно производство на ваксини е сравнително ново, но привлича нарастващ интерес в областта на вирусните вектори и VLP. Основното предимство на тази система е, че включва краткотрайно (няма нужда от създаване на клетъчни линии) и безопасно (без пълна вирусна ДНК) производство. Има и някои недостатъци, като необходимостта от отстраняване на бакуловирус и стабилност на продукта.
Cervarix, VLP ваксина срещу човешка папиломавирусна инфекция, произведена от GlaxoSmithKline, е първата човешка ваксина, произведена в търговската мрежа в клетки на насекоми. В момента се разработват редица ваксини, базирани на VLPs и rAAV вектори, произведени в инфектирани с бакуловирус клетки на насекоми. Клетъчните линии на насекоми, получени от есенния червей Spodoptera frugiperda (Sf9 и Sf21) и зелевия червей Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4 клетки) са най-често използваните поради способността им да растат в суспензия, което опростява амплификацията на нагоре по течението процес. След нарастване до желаната плътност на живи клетки, тези клетки се заразяват с рекомбинантен бакуловирус във фазата на експоненциален клетъчен растеж за експресия на протеин. Големият геном на бакуловирусите позволява експресията на пет или повече различни протеина, което съответства на сложността на VLP и вирусните вектори.
Bernard и др. описва процеса надолу по веригата на клетъчната култура на насекоми. Процесът е силно променлив, отразявайки разнообразието от протеини, произведени с тази техника. Първата стъпка от последователността на пречистване е силно повлияна от характеристиките на обема на биореактора (т.е. клетъчна плътност и жизнеспособност) или от естеството на освобождаването на продукта (секретиран чрез пъпкуване или клетъчен лизис). Бакуловирусната инфекция на клетките на насекоми може да причини клетъчен лизис в рамките на 3-5 дни. Разрушаването на клетките може да доведе до повишаване на протеолитичната активност и други фактори на околната среда, които могат да доведат до разграждане на рекомбинантни протеини.
Има опити за разработване на бакуловируси с по-ниска способност да инициират клетъчен лизис. Бакуловирусът лизира по-малко от 10 процента от заразените насекоми.
Клетъчният лизис може да се извърши с помощта на различни методи, като замразяване-размразяване, детергенти, хомогенизатори или ултразвукова обработка. Клетките на насекомите нямат клетъчна стена и затова се разтварят бързо. Въпреки че е докладвано ултразвуково третиране в много процеси на стенд, то рядко се използва в експериментален или търговски мащаб. Най-често срещаният метод е да се използва хомогенизатор за унищожаване на клетките в присъствието на детергент с ниска концентрация (0.1% Triton X-100 или NP-40). Използването на детергенти и микрофлуидизация или хомогенизация с осмотично въздействие са успешно използвани в много широкомащабни производствени процеси. Обикновено клетките на насекомите се суспендират в лизисни буфери (50 mM TRIS pH7.7, 300 mM NaCl, 5% глицерол, 0.2 mM PMSF и протеазни инхибитори), по време на което Triton-X100 се добавя до крайна концентрация от 0,1%, последвано от лек ултразвук или микрофлуидизация. След това сместа се центрофугира за отстраняване на неразтворимите частици.
На този етап лизатът може да изглежда много мътен и трудно се филтрира с помощта на 0.45μm филтър. Понякога могат да се наблюдават загуби до 30% по време на етапа на избистряне на пиролизата. Добавянето на бензоензими на етапа на разцепване помага за решаване на проблема с филтрацията. Почистването на клетките с фосфатно буфериран солев разтвор след прибиране на реколтата и бързото "замразяване-размразяване" в високо съдържание на сол (500 mM NaCl), съдържащ крекинг буфера, помага за отстраняването на агрегатите.
Избистряне на VLPs и вирусни вектори, произведени от клетки на насекоми, става след клетъчен лизис (чрез химично или механично третиране), който освобождава не само вирусни частици, но и големи количества клетъчна нуклеинова киселина. Клетките на насекомите могат да растат при висока клетъчна плътност от 1-9.10 6 клетки/ml. Следователно, етапът на избистряне трябва да се занимава с висока клетъчна плътност, високо съдържание на нуклеинова киселина и, ако е възможно, отстраняване на бакуловирусни частици. За да направят нещата по-сложни, VLPs или вирусните вектори и бакуловирусите могат да имат подобни размери (бакуловирусите са 60-80 нанометра широки и 300-400 нанометра дълги). Поради високата клетъчна плътност, центрофугирането е предпочитаната техника за първично избистряне от десетилетия. Въпреки това, мембранните процеси изглеждат много привлекателна алтернатива, тъй като скалируемостта е лесна за дефиниране.
Дълбоките филтри са използвани ефективно в процеса надолу по веригата на трислойни ротавирусоподобни частици. На лабораторно ниво методът за ултрацентрофугиране с градиент на плътност CsCl често се използва за пречистване на тези сложни частици. Изследователите оцениха не само стъпката на избистряне на дълбокия филтър, но и целия процес надолу по веригата (разцепване на Triton X-100 и дълбока филтрация, последвано от ултрафилтрация и изключване на размера на частиците). Резултатите показват, че добивът на CsCl градиент на плътност може да достигне 37%.
Ултрацентрофужният метод е около 10%. Като друг пример, 0,45 μm кухи влакна и 500 kDa влакна с фин диаметър бяха използвани за възстановяване и концентриране на ХИВ-подобни частици, произведени в клетки на насекоми. В това изследване силата на срязване на кухите влакна е оптимизирана въз основа на целостта на клетката. Резултати Беше установен процес с ниска сила на срязване, за да замени ултрацентрофугирането с градиент на трапезна захар.
Процесът има потенциал да се приложи в масово производство. Дълбоките филтри също са успешно използвани в производството на рекомбинантни адено-асоциирани вируси. Клетъчният лизис се извършва с двубутален механичен клетъчен заглушител, последван от третиране с нуклеаза. В етапа на избистряне беше използван филтърен елемент от 1,2 μm стъклени влакна, последван от два слоя от 0.8μm хидрофилен PES и 0.2μm хидрофилен PES. Филтри с пропорционален размер се използват за партиди от по-малки до 200 L размери. Дълбоките филтри са използвани успешно и оценките на TFF с плоски филми или кухи влакна от 0,2 µm или 0,45 µm също са докладвани като много ефективни.
Проучването на Tecnologica (IBET) в Института по експериментална биология Oeiras в Португалия използва NFF за извършване на избистряне на VLP на хепатит C, експресиран от бакуловируси без центрофугиране. Полипропиленови филтри с номинална оценка (10,5,0.6 и 0.3μm) се използват за избистряне на събирането на VLP. Същите филтри с 0.6μm и 0,3μm рейтинг на порите се използват за филтриране в центровете за събиране на VLP. Всички изследвани филтрати бяха тествани за степен на възстановяване на HCV-VLP и препоръчителните методи за филтриране бяха сравнени. Резултатите са показани в таблица 4.
Резултатите показаха, че филтърът от 5 μm-0.3μm има най-голямо възстановяване на продукта (100%) за директно събран хепатит C VLP фураж. Полипропиленовият 0,6 μm филтър има най-голямо възстановяване на продукта (82%) за централното захранване, а ДНК клирънсът на клетката гостоприемник е около 70%.
2.2.1.4 Вирусоподобни частици, произведени в бактериални или дрождени системи
Видът на метода за избистряне на VLP ваксини, експресирани в бактериални или дрождени системи, зависи от освобождаването на VLP към извънклетъчни медиатори. Ако VLP не могат да се секретират ефективно, може да се наложи клетъчен лизис или други етапи на екстракция преди действителния етап на избистряне. Въпреки че това е златният стандарт в индустрията за избистряне на протеини, центрофугиране (непрекъснато или на партиди), изразено в бактериални или базирани на дрожди системи, напоследък мембранните процеси се превърнаха в много привлекателна алтернатива поради тяхната лекота на мащабируемост и съвместимост с еднократна употреба лечения.
Richter и Topell обясняват използването на центрофугиране, TFF или комбинация от двете, когато се приготвят VLP, произведени в избистрена E. coli. В тяхната работа са използвани 0.45m TFF мембрани за разреждане и избистряне на хомогенизираните хомогенати на Е. coli при температура от 5 градуса. Те също така отбелязват, че базираният на мембрана TFF е подходящ за обработка на реколти с висок вискозитет, за предпочитане с използване на TFF единици с конфигурации на отворен канал.
Центробежното избистряне също е оценено като алтернатива на TFF. В този случай полученият хомогенат не се разрежда и се центрофугира при 4 градуса за 105 минути, 10000g. Без прехвърляне на мекото покритие, супернатантата се излива от частиците и се центрофугира повторно при 4 градуса и 10 000 g за 60 минути. След това супернатантата се отстранява от присъстващите частици, разрежда се с EB буфер (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris база, 5,0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2 и се филтрува върху 0,22 m стерилно филтърно устройство. Допълнителна обработка. Съобщава се, че процесът на увеличаване на производството на тази VLP ваксина в Е. coli в мащаб 800L също е изяснен чрез комбинацията от центрофугиране и TFF.
Рекомбинантната ваксина срещу хепатит Е HEV 239 е лицензирана в Китай за имунизиране на възрастни на 16 и повече години. Антигените на ваксината (VLP) се експресират в Е. coli и е доказано, че увеличаването на процеса на производство на антиген е в 50L скала. Продуктът се екстрахира чрез разбиване на Е. coli и включените тела се отделят от клетъчните фрагменти чрез обилно промиване с буфер, съдържащ 2% Triton X-100 и след това се разтварят с 4 М уреен хомогенизатор. TFF изяснява човешкия папиломен вирус VLP, произведен в Saccharomyces cerevisiae (15L). Клетъчният лизат, третиран с нуклеаза, се избистря чрез микрофилтрация с кръстосан поток в режим на трансфилтрация, като се използва 0.65 μm филтър с кухи влакна. Същият процес се използва при производството на ваксини. Въпреки че само няколко ваксини, базирани на VLP, са достигнали търговски мащаб, няколко ваксини, базирани на VLP, са в процес на разработка, повечето от които се избистрят с помощта на центрофугиране или мембранна технология.
Ограничени от влиянието на пространството, ще споделим втората половина от съдържанието в следващата глава. В следващата статия ще споделим някои случаи на изясняване на ваксината и използването на съответните мембранни компоненти.
Като първата компания във веригата за локализация, Guidling Technology натрупа достатъчно подходящ опит в изясняването на ваксини. Guidling Technology е компания за разработка и производство, фокусирана върху биофармацевтични и клетъчни култури, пречистване и разделяне. Продуктите се използват широко в биомедицината, диагностиката, промишлената филтрация на течности, откриването, избистрянето, пречистването и процеса на концентрация; Guidling успешно разработи епруветка за центрофуга за ултрафилтрация, мембранна касета за ултрафилтрация/микрофилтрация, филтър за отстраняване на вируси, филтърно устройство за тангенциален поток, стек с дълбока мембрана и т.н., които напълно отговарят на сценариите за приложение на биофармацевтични и клетъчни култури.
Нашите мембрани и мембранни филтри се използват широко в концентрацията, екстракцията и разделянето на предварителна филтрация, микрофилтрация, ултрафилтрация и нанофилтрация. Нашата широка гама от продуктови линии, от малки лабораторни филтри за еднократна употреба до системи за филтриране от производствен тип, тестове за стерилност, ферментация, клетъчни култури и други, могат да отговорят на нуждите от тестване и производство.
