Изследване на процеса на избистряне на ферментационен лизат с висока плътност на рекомбинантна Escherichia Coli

 

За да се намали намесата на материалната течност в хроматографията и да се подобри възстановяването на целевия протеин, беше изследван процесът на избистряне на ферментационен лизат с висока плътност на два щама на рекомбинантна Escherichia coli. Избрани са щамове BL21-HP1036 и BL21-palA, експресиращи ключови гени на Streptococcus suis и Haemophilus parasuis. Процес на тангенциален поток, процес на високоскоростно центрофугиране и процес на избистряне на мембранна касета бяха използвани за оценка на добива на протеин чрез откриване на мътност и електрофореза.

 

Резултатите показват, че BL21-HP1036, BL21-palA ферментационен лизат с висока плътност, експресиращ ключови гени на Streptococcus suis и Haemophilus parasuis, е избистрен чрез мембранна касетъчна филтрация и центрофугиране и добивът на протеин е над 80%, което може ефективно да намали хроматографската интерференция и да подобри степента на възстановяване.

 

Въведение

Понастоящем Streptococcus suis (SS) и Haemophilus parasuis (HPS) са най-често срещаните патогени на бактериални заболявания в свинефермите, които носят големи загуби на свиневъдството. SS може да бъде разделен на общо 35 серотипа 1-34 и 1/2, а HPS може да бъде разделен на 1-15 серотипа и двата често се смесват, като основно причиняват полисерозит при свинете, артрит, менингит, ендокардит , бактериална септицемия и бронхит.

 

Поради големия брой серотипове на Streptococcus suis и Haemophilus parasuis, кръстосаната защита между различните серотипове е слаба и антибиотичната резистентност ще се повиши значително при лечение с антибиотици, което ще повлияе на терапевтичния ефект.

 

Ваксините се превърнаха в едно от ефективните средства за предотвратяване на SS и HPS. Има инактивирани ваксини, атенюирани ваксини, живи ваксини, субединични ваксини и генетично модифицирани ваксини, но инактивираните ваксини и атенюираните ваксини са предимно на пазара и тяхната имунна защита е добра, но кръстосаната защита не е очевидна. Субединичната ваксина е нов тип ваксина срещу streptococcus suis, която е нов тип ваксина със силна кръстосана защита и ниска цена. Изследването и разработването на субединични ваксини срещу Streptococcus suis и Haemophilus parasuis предоставя перфектно решение на проблемите с превенцията и контрола на Streptococcus suis и Haemophilus parasuis, които измъчват свиневъдната индустрия в Китай.

 

Субединичните ваксини Streptococcus suis и Haemophilus parasuis се подлагат на ферментация с висока плътност от рекомбинантна Escherichia coli. Избистрянето на лизата има голям ефект върху добива на целевите протеини, но има малко подходящи доклади. Как да се реализира стъпката на избистряне на процеса на ферментация и пречистване е важна работа. В тази статия, рекомбинантна E. coli BL21-HP1036, BL21-palA ферментация с висока плътност като обект, за да се проучи как ефективно да се намали мътността на избистрящия разтвор, да се подобри добивът на протеин, за Процес на ферментация на субединица Streptococcus suis за постигане на промишлена технология за раздробяване и избистряне за осигуряване на теоретична основа и техническа поддръжка.

 

1. Материали и методи

1.1 Материали

 

1.1.1 Щамове

Щамове Streptococcus suis и Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 Основни среди и реактиви

Екстракт от мая и морска свиня; натриев хлорид; Канамицин, IPTG; Формалдехид от; SDS-PAGE гел комплект.

 

1.1.3 Основно оборудване за изпитване

Ферментатор с висока плътност; Високоскоростна центрофуга; Апарати за електрофореза; Система за ултравиолетови гел изображения; Ултразвукова трошачка; Малка високоскоростна центрофуга; Ултравиолетов спектрофотометър; Маса за разклащане с постоянна температура; Оборудване за афинитетна хроматография.

 

1.2 Методи

 

1.2.1 Ферментационна култура с висока плътност

Квалифицираните рекомбинантни колиформни щамове BL21-HP1036 и BL21-pa-lA бяха инокулирани върху синтетична среда при 2% (V/V) и култивирани при 37 градуса за 35-40 h.

 

1.2.2 Експресия, индуцирана от рекомбинантен протеин

Когато ферментационният разтвор OD{{0}}±0.1, индукцията започна, температурата на индукция беше 35 градуса ±0,5 градуса и култивирането приключи след 10 часа индукция.

 

1.2.3 Хомогенно раздробяване и центрофугиране под високо налягане

Течността на бактериите, преминала теста за инактивиране, се раздробява чрез хомогенизатор под високо налягане за клетъчно напукване, съответно, с налягане от 100 ~ 150 MPa. След раздробяването натрошената течност се държи при ниска температура.

Супернатантата се получава чрез центрофугиране с висока скорост, центробежна скорост: 15000 rpm, контрол на температурата: 10 градуса ~15 градуса, скорост на инжектиране: 0,5~1 L/min, съответно, супернатантата се събира и супернатантът се пълни с контейнери, които отстраняват ендотоксина.

 

1.2.4 Избистряне на касета с микрофилтрационна мембрана

Мембраната се промива с 1 0 L пречистена вода в една посока и се извършва тангенциално филтриране на потока. 300 mL от разбитата бактериална суспензия след центрофугиране се вземат от тръбопроводната центрофуга и се избистрят с 0,45 um микрофилтрационна мембранна касета. Мътността се измерва съответно чрез вземане на проби и се сравняват мътността след центрофугиране, мътността на избистрената течност в касетата с микрофилтрационна мембрана и мътността на концентрираната течност в касетата с микрофилтрационна мембрана. Съдържанието на протеин в пробата се открива чрез хроматография и електрофореза, за да се оцени добивът на протеин.

 

Стъпка 2: Резултати

2.1 Данни за изясняване и резултати от тестове на BL21-HP1036 и BL21-palA протеин

Резултатите на фиг. 1 показват, че мътността на BL21-HP1036 и BL21-palA рекомбинантна Escherichia coli течност за раздробяване е намаляла от 4 500 NTU и 4 000 NTU съответно до 1970 NTU и 520 NTU, след центрофугиране на епруветка. Мътността на BL21-HP1036 и BL21-palA рекомбинантна Escherichia coli беше намалена до 25 NTU и 1,28 NTU чрез микрофилтрационен мембранен касетен метод. Може да се види, че използването на микрофилтрационна мембранна касета за тангенциално филтриране на потока и оптимизиран отворен канал за поток има добър ефект върху намаляването на ендотоксина, вискозитета и мътността на хроматографската течност в сравнение с традиционната центрофужна филтрация и може значително да намали разбития рекомбинантен хетеропротеин на Е. coli и нуклеинова киселина.

 

2.2 Възстановяване на протеин от проби BL21-HP1036 и BL21-palA

Таблица 1 показва, че рекомбинантният протеин Escherichia coli BL21-HP1036 съществува както в избистрения чрез микрофилтруване разтвор, така и в концентрирания супернатант, покрит от мембраната за микрофилтруване, и общия добив на протеин след възстановяване на протеина от избистрения чрез микрофилтруване разтвор и концентрираната супернатанта е около 88,5%. BL21-palA протеин също съществуваше в избистрения разтвор на ексудат от микрофилтрация и супернатантата на концентрирания разтвор, покрита с касета с микрофилтрационна мембрана. Общият добив на BL21-PALa протеин е 81,5%.

 

3. Заключение

В тази статия щамовете, експресиращи ключовите гени BL{{0}}HP1036 и BL21-palA на Streptococcus suis и Haemophilus parasuis съответно претърпяха ферментация с висока плътност и преминаха 0,45. Мътността на материалната течност беше значително намалени чрез процеса на микрофилтрационна мембранна касета um, което показва, че технологията за филтриране на тангенциален поток с микрофилтрационна мембранна касета е по-добра от тази с високоскоростна центрофуга и може значително да намали примесния протеин и нуклеиновата киселина на разбитата рекомбинантна Escherichia coli.

 

След събиране на бистрата течност в касетата с единична микрофилтрационна мембрана имаше 62,9% As 37,1% от целевия протеин на BL21-HP1036 беше микрофилтрационен концентрат или съществуваше в касетата с микрофилтрационна мембрана и други загуби , за изясняване беше приет двуетапен метод. В първия етап се използва 0,45 um микрофилтрационна мембранна касета за избистряне и събиране на ексудата; във втория етап останалата концентрирана течност беше събрана след центрофугиране в епруветка и двуетапната избистрена течност беше комбинирана като хроматографска проба Стойността на мътност на ферментационната течност BL21-palA не се увеличи значително, добивът на протеин може да достигне повече от 85,5%, а добивът на протеин от BL21-Pala ферментационна течност може да достигне 81,5% след двуетапно третиране.

 

Що се отнася до това как да изберете касетата с микрофилтрационна мембрана, Guidling Technology може да ви предостави висококачествени решения. Нашите продукти от серията касети с микрофилтрационна мембрана и ултрафилтрационна мембрана използват полиетер сулфон като носител, специално проектиран за биотехнологии. Нашата полиетер сулфонова мембрана има предимствата на висока производителност, ниска протеинова адсорбция, висока механична якост, устойчивост на удар и т.н. Ние ви предоставяме специални мембранни скоби за измерване на налягането на входа и изхода в реално време и можем да осигурим технически посещения според вашите нужди, за да персонализирате вашата специална система за ултрафилтрация/микрофилтрация. Такава система с малък тангенциален поток може да се използва за малко, пилотно и дребномащабно производство и може да бъде напълно линейно усилване, за да отговори напълно на вашите изисквания за изпитване и производствени изисквания.

Относно Guidling

Guidling Technology е национално високотехнологично предприятие, фокусирано върху биофармацевтични продукти, клетъчни култури, пречистване и концентрация на биомедицина, диагностика и индустриални течности. Ние успешно разработихме центробежни филтърни устройства, ултрафилтрационни и микрофилтрационни касети, вирусен филтър, TFF система, дълбочинен филтър, кухи влакна и т.н. Които напълно отговарят на сценариите за приложение на биофармацевтични продукти, клетъчни култури и т.н. Нашите мембрани и мембранни филтри се използват широко при концентрация, екстракция и разделяне на предварителна филтрация, микрофилтрация, ултрафилтрация и нанофилтрация. Нашите многобройни продуктови линии, от малка лабораторна филтрация за еднократна употреба до производствени филтриращи системи, тестове за стерилност, ферментация, клетъчни култури и други, отговарят на нуждите от тестване и производство. Guidling Technology очаква с нетърпение да си сътрудничи с вас!