Технология за инактивиране и премахване на вируси от кръвни продукти

Кръвните продукти са „плазмени протеинови компоненти или компоненти на кръвни клетки, като човешки кръвен албумин, човешки имуноглобулин, човешки коагулационен фактор (естествен или рекомбинантен) концентрат на червени кръвни клетки и др., отделени от здрава човешка плазма или специфично имунна човешка плазма, пречистена или направени чрез рекомбинантна ДНК технология, за диагностика, терапия или пасивна имунопрофилактика“. Кръвните продукти играят важна роля в спешната медицинска помощ, спасяването на ранени от войната и превенцията и лечението на някои специфични заболявания.

 

Регулаторна основа

Практиките за осигуряване на безопасност трябва да гарантират, че крайното лекарство е безопасно за регулаторите и в крайна сметка за пациентите и обществото. През 1990 г. Международната координационна конференция (ICH 1998) издаде "Q5A: Оценка на вирусна безопасност на биотехнологични продукти от човешки или животински произход клетъчни линии" (Q5A: Оценка на вирусна безопасност), установявайки световен стандарт за вирусна безопасност.

ICH Q5A описва многостепенна схема за тестване и валидиране на изчистване за постигане на тази цел. Програмата за тестване се фокусира върху клетъчна банка, събиране на суровини и биореактори, допълнени от анализ на риска на продукта. В допълнение към тестването, ICH Q5A изисква обеззаразяването надолу по веригата да бъде оценено като безопасна мярка, когато не бъдат открити замърсители нагоре по веригата. Проверката на разрешението гарантира, че ако някой вирус избегне режима на тестване, той може да бъде отстранен и/или инактивиран, преди да попадне в крайния лекарствен продукт.

 

Предистория на цялостната програма за защита от вируси

В съвременното биотехнологично производство (или биообработка) обикновено има три или четири единични операции в цялата пречистена последователност, способни да отстранят или инактивират вируса. Това включва определени хроматографски стъпки (като протеин А или анионен обмен), култура с ниско pH или детергенти и филтри за задържане на вируси. Не всички от тези стъпки ще премахнат или деактивират ефективно всички вируси.

Например културата с ниско pH обикновено е неефективна за инактивиране на необвит вирус, но работи добре за инактивиране на вирус с обвивка. При определени работни условия, анионобменната колона може да не е в състояние да свърже и отстрани неутралните изоелектрични вируси от продуктовия поток, но е ефективна срещу киселинни вируси.

Това е комбинация от три до четири независими и ортогонални операции на единица, които заедно гарантират вирусната безопасност на биотехнологичните продукти.

 

Обикновено се приема, че стабилна, ефикасна и надеждна стъпка на обработка ще може да премахне или дезактивира голям брой вируси (обикновено дефинирани като 4 log10 или повече, където стойността на log намаление или LRV се изчислява като log10 от общия брой вируси във входа, разделен на общия брой вируси в изхода). LRV обаче не може да се използва като единствена абсолютна мярка за ефективността на дадена стъпка. Възможно е данните да са предварителни. Той е лесен за моделиране, сравнително нечувствителен към промени в условията на процеса и ефективен срещу редица вируси (WHO 2004).

Вирусната филтрация е широко призната като толкова мощна и ефективна стъпка на процеса и е ключов компонент от цялостната стратегия за минимизиране на риска от екзогенни и ендогенни вирусни частици по време на производството на биотехнологични продукти.

Вирусните филтри често работят чрез силни, базирани на размера механизми за задържане. Въз основа на този мощен механизъм на действие, вирусните филтри са по-склонни от хроматографските стъпки да осигурят предвидимо вирусно задържане за редица вируси. Това е така, защото е по-малко вероятно филтърът да бъде повлиян от разликите във физикохимичните свойства на различните вируси и взаимодействията вирус-смола, регулирани от работните условия. Следователно, етапът на вирусна филтрация обикновено се използва в добре проектирани процеси за пречистване на рекомбинантни терапевтични протеини (EMEA 1996), за които също е доказано, че имат стабилна производителност в индустрията за обработка на плазма.

 

Кръвните продукти обаче са като нож с две остриета, който не само спасява хиляди животи, но също така има възможност да разпространява болести и да представлява заплаха за човешкото здраве. Според статистиката от 1977 до 1984 г. най-малко 30000 реципиенти на кръв в Съединените щати са получили кръв, заразена с вируса на СПИН. През 1985 г. 1200 от 3000 хемофилици във Франция са били заразени със СПИН чрез кръвопреливане или кръвни продукти.

Според Световната здравна организация 5% до 10% от инфекциите със СПИН по света са причинени от преливане на заразена със СПИН кръв или кръвни продукти. Първият случай на СПИН в Китай е заразен чрез използване на вносни кръвни продукти, заразени с вируса на СПИН. Освен това се съобщава за предаване на заболявания с хепатит B и C, дължащи се на кръвопреливане и кръвни продукти.

 

1. Основни вируси, предавани чрез кръвни продукти и техните характеристики

Има много видове вируси, които се предават чрез кръв и кръвни продукти, както е показано в таблица 1. Сред тях ХИВ, HBV и HCV са загрижени от местни и чуждестранни медицински кръгове поради високия им процент на заразяване и сериозни увреждания.

Тъй като кръвта и кръвните продукти имат възможността да разпространяват вируси, това сериозно повлия на приложението им в превенцията и лечението на заболявания. Следователно при производството на кръвни продукти трябва да се добавят процеси за инактивиране и премахване на вируса, за да се гарантира безопасността на кръвните продукти.

2. Основни методи за инактивиране и отстраняване на вируса

За да се гарантира безопасността на кръвните продукти, в допълнение към подбора на кръводарители, имунизацията, когато е възможно, и стриктното тестване на взетата кръв и други мерки, инактивирането и премахването на вирусната обработка на кръвни продукти е важна връзка за гарантиране на безопасността на кръвопреливането. Няколко често използвани и ефективни метода за дезактивиране и премахване на вируси са описани подробно по-долу.

 

I. Методи за инактивиране на вируси

1. Метод на Пастьор

Теоретичната основа на този метод е, че степента на разрушаване на вирусната структура е много по-висока от тази на протеиновата структура чрез избор на температура и време на действие. Близо 50 години резултати от клинична употреба и скорошни експерименти с животни потвърдиха, че албуминът в разтвор след 60 градуса, 10 часа нагряване, тоест дезинфекция на Пастьор, може не само да дезактивира HBV, но също така да инактивира HCV и HIV, което прави албумина най-надеждният кръвен продукт за вирусна безопасност.

Наскоро процесът на Пастьор беше разширен до производството на IVIG, FVI, FIX, фибриноген и други продукти. Bridonnccu и др. добавя този процес на инактивиране на вируса към процеса на производство на етанол при ниска температура IVIG, т.е. методът на Пастьор е приложен при условия на липса на стабилизатор, ниска сол и киселинност и титърът на вируса намалява с 5 Log. Симъндс и др. тества вирус, предаван чрез трансфузия (TTV) на FVⅢ и FIX концентрирани препарати, клинично използвани в Обединеното кралство, и установи, че степента на откриване на TTV на продукти без инактивиране на вируса на Пастьор е 50% до 75%, а положителният процент на откриване на продукти след инактивиране на Пастьор беше 0.

Позитивният процент на TTV е бил 27% при 84 пациенти с хемофилия в Обединеното кралство, които са използвали продукти с неинактивиран фактор на кръвосъсирването, докато само 1 от 19 пациенти, използващи продукти с инактивиран фактор на кръвосъсирването, е бил положителен, с положителен процент на откриване от 5%. Следователно процесът на инактивиране на вируса е много ефективен за подобряване на безопасността на кръвните продукти.

 

2. Органичен разтворител, комбиниран с повърхностно активно вещество (S/D метод)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Голям брой кръвни продукти, инактивирани чрез S/D метода, са доказани като безопасни и надеждни чрез дългосрочно клинично приложение, така че те се използват широко. Въпреки това, този метод няма инактивираща способност срещу парвовирус B19, HEV и други непокрити с липо вируси.

 

3. Метод за инактивиране на суха топлина

Инактивирането чрез суха топлина означава, че лиофилизираният препарат се обработва чрез нагряване и вирусът се убива чрез суха топлина. Често използваните методи за суха топлина са 60 градуса ~80 градуса, 10~72 часа метод на нагряване и 80 градуса, 72 часа метод на лечение. Още в началото на 80-те години на миналия век беше полезно да се нагрява FVIII лиофилизиран концентриран препарат и протромбинов комплекс при 60 градуса ~ 80 градуса за 10 ~ 72 часа. Доказано е обаче, че този метод не може напълно да инактивира HBV, HCV, HIV. Доказано е, че сухата топлинна обработка при 80 градуса и 72 часа е ефективна при инактивиране на HBV, HCV и HIV. Има също скорошни съобщения за лиофилизирани препарати от коагулационни фактори, третирани при 100 градуса. Xu Jinbo et al третират IgG при 100 градуса за 30 минути и инактивират вируса на везикуларен стоматит 8.2 Log. Някои хора ще изсушат чрез замразяване FVIII при 68 градуса за 72 часа, в сухо състояние и след това ще го нагреят при 100 градуса за 0,5~1 час. Този метод е сравнително икономичен.

 

4. Фотохимичен метод

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Регистрация на клетките, свързани с HIV, и тромбоцитите остават добри след 7 дни функционално запазване in vitro, което е одобрено от FDA за клинични изпитвания.

Сред тези методи методът на дезинфекция на Пастьор и методът S/D са одобрени от FDA на Съединените щати и се използват широко в света. Методът на инактивиране със суха топлина е подходящ главно за инактивиране на вируси на лиофилизирани препарати. Фотохимичният метод има силен инактивиращ ефект върху покрити с липиди вируси и е използван за инактивиране на вируси в цяла плазма в Европа и има широки перспективи за инактивиране на вируси в компонентите на кръвните клетки. Въпреки това, всички тези методи имат своите недостатъци, като стерилизацията на Пастьор не е идеална за инактивиране на някои топлоустойчиви вируси; S/D методът не може ефективно да инактивира непокрития с липо вирус вирус. Фотохимичният метод значително уврежда активността на някои плазмени протеини. Настоящото клинично използване на последващи изследвания показва, че нито един метод за инактивиране на вируси не може да гарантира, че кръвните продукти са абсолютно свободни от риска от предаване на вируси.

 

I. Процес на премахване на вируси

При производството на кръвни продукти един процес на инактивиране не може да деактивира всички вируси; В допълнение, самият вирус е хетероложен протеин, като въвеждането с продукта ще доведе до нежелани реакции; В същото време, поради ограничението на техническото ниво, все още има вируси, чиито характеристики не са открити или разбрани, така че съществуващите методи за инактивиране на вируси не могат да гарантират ефекта на дезактивиране на тези вируси. Поради това дезактивирането само по себе си не може да гарантира безопасността на продукта и трябва да бъде премахнато от продукта. Така че технологията за премахване на вируси привлича все повече внимание. Два често използвани и ефективни процеса за премахване на вируси са описани накратко по-долу.

1. Хроматографска технология

Хроматографската технология се отнася до използването на различни компоненти и разлики в афинитета на стационарната фаза или взаимодействието, за да се постигне разделяне на различни компоненти. Като усъвършенствана технология за производство на кръвни продукти, самата хроматография има ефект на премахване на вируси, особено афинитетната хроматография и йонообменната хроматография. За йонообменна хроматография елуирането има предимства пред проникването при отстраняване на вируса. Таблица 2 показва статистическите данни за степента на отстраняване на HAV чрез хроматографска технология в процеса на производство на албумин от CSL Company в Австралия. Както може да се види от таблица 2, йонообменната хроматография и гел филтрацията са по-ефективни при отстраняване на HAV, с обща скорост на отстраняване от 10,9 Log.

При производството на FVIII Baxter Healtheare извършва имуноафинитетна хроматография, използвайки третирани с анти-FVIII антитела гелове, които могат да премахнат (4,2±0.1)Log и (5,3±0.9)Log от не -вируси с липидно покритие като PPV и HAV, съответно.

 

2. Филтриране с нанофилм

За някои вируси с малък повърхностен диаметър, като HAV и парвовирус B19, наномембранната филтрация е най-ефективният метод за отстраняване. Той се възползва от разликата в размера между протеините и вирусите и адсорбцията на вируси от филтърната мембрана, за да изолира вируси. Беше проведено лабораторно изследване в Sanquin Blood Supply Site в Холандия за отстраняване на вируси чрез добавяне на едноетапна, двустепенна наномембранна филтрация Planova 15N към процеса на производство на протромбинов комплекс. Установено е, че степента на отстраняване на HIV, HAV и други вируси е повишена в различна степен след наномембранна филтрация (виж Таблица 3).

Въпреки това, могат да възникнат следните проблеми, когато този метод се прилага за промишлено производство: Първо, поради високия вискозитет на продукта и наличието на протеини с голям диаметър, размерът на порите на мембраната, избрана от филтъра, не трябва да бъде твърде малък, като по този начин се ограничава отстраняването на вируси с малък диаметър като HCV; Второ, стабилността на контрола на размера на порите на мембраната в процеса на производство на филтър ще повлияе на отстраняването на вируса. Трето, когато отворът на мембраната, по-малък от диаметъра на вирусната частица, е блокиран, скоростта на потока на продукта ще бъде намалена, което ще повлияе на добива. Следователно изборът на мембрани, чиито свойства и размер на порите са подходящи за нуждите на преработените продукти, е важен фактор за това дали наномембранната филтрация може да премахне вирусите.

 

3. Дискусия

Съгласно предпоставката за осигуряване на качеството на източника на кръв, процесът на инактивиране и отстраняване на вируса е важно и необходимо средство за гарантиране на безопасността на кръвните продукти. Използването само на един инактивиран вирусен процес не може да гарантира абсолютно безопасността на кръвните продукти. На базата на технологията за инактивиране на вируси беше добавена технология за отстраняване на вируси като хроматография и филтриране с нанофилм, скоростта на отстраняване на вируси беше значително увеличена и ефектът на инактивиране и премахване на вируси беше значително подобрен. Понастоящем Европа ясно предложи в процеса на производство на кръвни продукти да се използва поне едно инактивиране и отстраняване на вируси, за да се гарантира безопасността на кръвните продукти.

В Китай повечето производители на кръвни продукти използват само един процес на инактивиран вирус в производствения процес, като метода на дезинфекция на Пастьор, S/D метода и т.н., но не използват процеса на отстраняване на вируса, което сериозно засяга качеството на кръвните продукти. С присъединяването на Китай към СТО производственият процес и стандартите за качество на местните кръвни продукти ще бъдат в съответствие със световните, в противен случай той не може да гарантира съществуващия вътрешен пазарен дял, но също така не може да се конкурира с подобни продукти в други страни в международен пазар.

Поради това производителите на кръвни продукти в Китай трябва да подобрят производствения процес, да засилят инактивирането и премахването на вируса, така че да гарантират напълно качеството и безопасността на продукта. Следователно ще бъде тенденция китайските производители на кръвни продукти да използват хроматография за пречистване на кръвни продукти и премахване на вируси, за да гарантират безопасността на кръвните продукти.

 

Относно Guidling

 

Guidling Technology е национално високотехнологично предприятие, фокусирано върху биофармацевтични продукти, клетъчни култури, пречистване и концентрация на биомедицина, диагностика и индустриални течности. Ние успешно разработихме центробежни филтърни устройства, ултрафилтрационни и микрофилтрационни касети, вирусен филтър, TFF система, дълбочинен филтър, кухи влакна и т.н. Които напълно отговарят на сценариите за приложение на биофармацевтични продукти, клетъчни култури и т.н. Нашите мембрани и мембранни филтри се използват широко при концентрация, екстракция и разделяне на предварителна филтрация, микрофилтрация, ултрафилтрация и нанофилтрация. Нашите многобройни продуктови линии, от малка лабораторна филтрация за еднократна употреба до производствени филтриращи системи, тестове за стерилност, ферментация, клетъчни култури и други, отговарят на нуждите от тестване и производство. Guidling Technology очаква с нетърпение да си сътрудничи с вас!