Кратка дискусия на няколко уникални метода на кухи влакна в инклюзивното пречистване на тялото

Телцата за включване (IB) са неразтворими протеинови частици с висока плътност, обвити в мембрани, образувани, когато чужди гени се експресират в прокариотни клетки, особено в Escherichia coli. Когато се наблюдава под микроскоп, IB е област с висока степен на пречупване, която очевидно е различна от другите компоненти в цитоплазмата.

Образуването на телца на включване е относително сложно, свързано със скоростта на производство на протеини в цитоплазмата, концентрацията на новосъздадените пептиди е висока и няма достатъчно време за сгъване, така че да се образуват аморфни протеинови агрегати. Телцата на включване са основно съставени от протеини, повече от 50% от които са клонирани продукти. Първичната структура на тези продукти е напълно правилна, но триизмерната конфигурация е грешна, така че няма биологична активност. Размерът на включеното тяло е 0.5-1μm, неразтворимо във вода, разтворимо само в денатуранти като урея, гуанидин хидрохлорид и др.

В Е. coli телцата на включване могат да се появят на две места в клетката: цитоплазма и периферна цитоплазма. Местоположението и характеристиките на включените тела в клетката зависят от това как се експресират протеините.

Включванията в цитоплазмата на E. coli обикновено варират в диаметър от {{0}}.2 до 1,5 μm, а различните протеини имат различни диаметри, като например размерът на интерферона е 0,811 μm, а размерът на prorennet е 1,281 μm. В някои случаи диаметърът на някои телца за включване е по-голям от диаметъра на E. coli, което придава на E. coli изпъкналост. По принцип една клетка има само едно тяло на включване.

 

Включване на пречистване на тялото

 

Процесът на пречистване на тялото на включване обикновено е:

Раздробяване на клетки:

Общата технология на клетъчно раздробяване е: високоскоростно раздробяване на тъкани, хомогенизиране на стъклен хомогенизатор, ултразвукова обработка, метод на многократно замразяване-размразяване, химическа обработка (обикновено с използване на обработка с лизозим).

 

Включване на измиване на тялото:

Включващите тела са неактивни твърди частици, образувани от вътреклетъчна аглутинация на протеини, експресирани от бактерии, които обикновено съществуват в аморфна, неразтворима форма. В тялото на включване истинският целеви протеин представлява само около 50%, а останалата част съдържа липиди, липополизахариди, нуклеинови киселини и хетеропротеини, които са свързани с тялото на включване и влияят на ренатурацията на протеина в тялото на включване. Следователно измиването преди денатуриране е много необходима стъпка.

В допълнение, промиването на включващите тела е полезно за увеличаване на добива на повторно нагъване на рекомбинантни протеини. Чрез премахване на примесите препятствията в процеса на ренатурация могат да бъдат намалени, така че протеинът да може да бъде по-ефективно сгънат и сглобен правилно, като по този начин се подобрява активността и функцията на протеина‌.

При пране обикновено се използва по-малко от 1% от неутралния детергент, като Tween, Triton, Urea и NP40 плюс EDTA и редуциращи агенти 2-меркаптотреитол (DTT), -меркаптоетанол, повтаря се много пъти, тъй като капацитетът на измиване на детергента се подобрява с увеличаването на йонната сила на разтвора, при измиването на включените тела може да се добави NaCl за увеличаване на йонната сила.

Телата на включване могат да се използват за отстраняване на други компоненти от разтвора за разграждане на клетките чрез центрофугиране или филтриране, като и двете се възползват от различни физически свойства на телата на включване.

 

Центрофугиране:

Протеините на включващите телца са много по-плътни от същия обем клетъчни фрагменти, така че включващите телца могат да бъдат отделени от останалата част на клетката чрез центрофугиране. Непрекъснатото центрофугиране е най-често използваната операция за получаване на включени тела в промишленото производство. Тъй като плътността на клетъчните фрагменти е по-малка от тази на включващото тяло, скоростта на утаяване е по-малка от тази на включващото тяло. Непрекъснатото суспендиране и центрофугиране може да центрофугира по-голямата част от тялото на включването, докато клетъчните фрагменти се отстраняват постепенно.
Филтриране (тангенциално филтриране на потока): Поради различните молекулни размери на включените тела и разтворимите протеини, може да се използва методът на филтриране, което може да намали оперативните разходи и да улесни мащабирането. Филтрирането на тангенциалния поток (TFF) се задвижва от разликата в трансмембранното налягане. Вещества и примеси, по-малки от размера на порите на мембраната, преминават през мембраната, докато примеси като клетки с по-големи частици се улавят. Отворът на мембраната, който обикновено се използва за промиване чрез филтриране, е 0.1μm. Микрофилтрацията с тангенциален поток от кухи влакна може директно да се справи с високо съдържание на твърдо вещество на течен материал, по-малко стъпки, проста работа, мембраната може да се използва многократно чрез почистване, намаляване на инвестициите в оборудването и оперативните разходи, в съответствие с изискванията на модулното автоматизирано производство.

 

Следващото е случай на приложение за измиване на вградено тяло с помощта на колони с кухи влакна Guidling.

Използвахме 94cm2 0.1-0.45μm кухи влакна, за да концентрираме 250mL течност (молекулно тегло на целевия протеин 17kd). В целия процес на измиване бяха изследвани степента на възстановяване на целевия протеин и изчерпването на мембранния поток.

0-71min е процесът на концентрация, 71-224min е процесът на измиване и филтриране. По време на целия процес на микрофилтрация TMP постепенно се увеличава, скоростта на входа на течността остава непроменена и средният поток на материала е 12LMH.

Резултатите показват, че целевият протеин е напълно уловен и степента на възстановяване на целевия протеин е повече от 90%. Водещите колони от кухи влакна са стабилни и подходящи за това приложение.

 

Разтваряне на тялото на включване:

Телцата на включване обикновено се разтварят при условие на денатуриращ агент урея или гуанидин хидрохлорид и разтворените протеини на телца на включване са напълно денатурирани, т.е. с изключение на запазването на първичната структура и ковалентните връзки, всички водородни връзки и хидрофобни връзки са унищожени и хидрофобни страничните вериги са напълно изложени.

Уреята и гуанидин хидрохлоридът са денатуранти със средна сила, които лесно се отстраняват чрез диализа и ултрафилтрация. Общата концентрация на урея 8-10M, гуанидин хидрохлорид 6-8M. Разтварянето на карбамид има предимствата на нейонизация, неутрално, ниска цена, отстраняването на протеин след ренатурация няма да причини голямо количество протеинова утайка, а разтворените включени тела могат да бъдат пречистени чрез различни хроматографски методи, така че е широко използван .

 

Повторно нагъване на протеини на тялото на включване:

Разтвореният рекомбинантен протеин трябва да бъде сгънат правилно, за да образува функционален протеин. Техниките за ренатуриране включват разреждане на протеиновия разтвор до почти неутрален, отстраняване на денатуранта, ренатуриране върху колона и гел филтрационна хроматография. Сред тях разреждането на протеиновия разтвор до почти неутрален и отстраняването на денатуранта е често срещан класически метод за ренатуриране, особено методът на ренатуриране с разреждане има най-висок процент на използване.

Отстраняване на денатурант:

Диализа: Предимството е, че обемът не се увеличава и скоростта на отстраняване на денатуранта се контролира чрез постепенно намаляване на концентрацията на външната пропусклива течност, но отнема много време и е лесно да се образуват неактивни протеинови агрегати, което не е подходящо за широкомащабна операция и не може да се приложи в производствения мащаб.

Ултрафилтрация (TFF): лесна за контролиране скоростта на диализата, независимо дали в научноизследователска и развойна дейност, пилотен тест или производство, може да премахне денатурантите (промяна на течността + концентрация) чрез ултрафилтрация (TFF).

 

Включване на протеиново пречистване на тялото:

Методите за пречистване на протеини след ренатурация са подобни на тези за пречистване на разтворими протеини, а именно йонообменна хроматография, хроматография с гел филтрация, афинитетна хроматография, утаяване с изсоляване на амониев сулфат и др.

Телцата на включване нямат биологична активност, няма нужда да се тревожите за загубата на протеинова активност и големи количества експресия няма да доведат до клетъчна смърт и ще увеличат максимално устойчивостта на протеазна атака. Кухите влакна Jiuling могат да се прилагат гъвкаво в процеса на пречистване надолу по веригата на включващите тела. В етапа на измиване на корпуса на включване, отлична производителност, в сравнение с центробежно измиване, използването на кухи влакна с микрофилтрация от девет възрасти за измиване с тангенциална филтрация на потока може значително да съкрати времето на процеса и общата степен на възстановяване може да достигне повече от 90%. Кухите влакна Jiuling могат също да се използват в етапа на ренатурация на протеини на включващи тела. Мътността на захранващата течност, филтрирана чрез микрофилтрация с кухи влакна, ще бъде значително намалена и степента на възстановяване на протеина е висока; Използването на ултрафилтрационни кухи влакна може не само да премахне денатурантите, но и да съкрати времето за зареждане на хроматографската проба, така че да спести време, да намали обема на пълнителя и да намали производствените разходи. Степента на възстановяване при микрофилтрация/ултрафилтрация с кухи влакна варира в зависимост от различните материали и общата степен на възстановяване може да достигне 90-95%.

Guidling Technology ви приветства да поискате тестови комплекти за свързани прегледи.

 

Относно Guidling

Guidling Technology е национално високотехнологично предприятие, фокусирано върху биофармацевтични продукти, клетъчни култури, пречистване и концентрация на биомедицина, диагностика и индустриални течности. Ние успешно разработихме центробежни филтърни устройства, ултрафилтрационни и микрофилтрационни касети, вирусен филтър, TFF система, дълбочинен филтър, кухи влакна и т.н. Които напълно отговарят на сценариите за приложение на биофармацевтични продукти, клетъчни култури и т.н. Нашите мембрани и мембранни филтри се използват широко при концентрация, екстракция и разделяне на предварителна филтрация, микрофилтрация, ултрафилтрация и нанофилтрация. Нашите многобройни продуктови линии, от малка лабораторна филтрация за еднократна употреба до производствени филтриращи системи, тестове за стерилност, ферментация, клетъчни култури и други, отговарят на нуждите от тестване и производство. Guidling Technology очаква с нетърпение да си сътрудничи с вас!