Приложение на ултрафилтрация при производството на човешка ваксина срещу бяс

За да се насърчи прилагането на ултрафилтрация при производството на човешка ваксина срещу бяс, 300 kDa ултрафилтрационна мембранна касета беше използвана за концентриране на разтвора за събиране на вируса на бяс и откриване на възстановяването на антигена, скоростта на отстраняване на ендотоксина и скоростта на отстраняване на протеина на гостоприемника след ултрафилтрация. Резултатите показват, че при подходящо налягане разтворът за събиране на вируса на бяс е концентриран 80 пъти, елуиран 25 пъти, степента на възстановяване на антигена е 86.2%, скоростта на отстраняване на бактериалния ендотоксин е 87,5% ~ 88,7% и скоростта на отстраняване на протеина на гостоприемника е 91,6%.

 

Предговор

 

Бясът е традиционна, древна зоонозна болест, причинена от вируса на бяс (RV), с процент на смъртност до 100%. Понастоящем няма ефективно лечение за постекспозиция (т.е. увреждане на кожата и лигавиците), освен спешна ваксина и ваксинация с имуноглобулин. Основният източник на бяс при хората са ухапвания от болни или потенциално заразени животни (главно кучета). Смъртността от бяс в Китай е на второ място в света, а бясът е един от проблемите, застрашаващи сигурността на общественото здраве у нас. Капсулният гликопротеин на вируса на бяс, който е единственият ключов антиген, който индуцира производството на защитно неутрализиращо антитяло, е бил в центъра на изследванията и разработването на нови ваксини и нови технологии за диагностика и лечение на вируса на бяс.

 

Вирусът на бяс принадлежи към рода вирус на бяс от семейството на рабдовирусите. Формата на нуклеокапсида е еластична, нуклеокапсидът е спирално симетричен и повърхността има обвивка, съдържаща едноверижна РНК. Това е патогенът, който причинява бяс. Вирусът на бяс има два основни антигена: единият е гликопротеиновият антиген на външната мембрана на вируса, който може да се свърже с ацетилхолиновия рецептор, за да направи вируса невротоксичен и да произведе неутрализиращи антитела и антитела, инхибиращи хемаглутинацията в тялото, и неутрализиращите антитела имат защитен ефект; Другият е вътрешният рибопротеинов антиген, който може да накара тялото да произвежда комплемент-свързващи антитела и преципитин и няма защитен ефект.

 

Ендотоксинът е вид липополизахаридно вещество (LPS), което има устойчивост на топлина и химическа стабилност и не е лесно да бъде унищожено. Ако има определена концентрация на ендотоксин във ваксината, това ще причини тежка треска и дори смърт след ваксинацията, така че съдържанието на ендотоксин във ваксината трябва да се намали възможно най-много. Изданието от 2005 г. на Китайската фармакопея (част III) определя, че контролната стойност на квалифицирания индекс на ендотоксина на ваксината срещу бяс не трябва да бъде по-висока от 100EU/доза. С бързото развитие на технологията за мембранно разделяне, прилагането на технология за ултрафилтрационно мембранно разделяне за намаляване на съдържанието на ендотоксин във ваксините става все по-широко разпространено във фармацевтичната индустрия.

 

Ваксината срещу бяс е ваксина срещу бяс. Обикновено има три вида ваксини срещу бяс, включително пречистена Vero клетъчна ваксина, човешка диплоидна клетъчна ваксина и ваксина от първична клетъчна култура. Ваксината срещу бяс се прави чрез инокулиране на фиксиран вирус на бяс в клетъчна матрица след култивиране, събиране, концентрация, инактивиране, пречистване и добавяне на подходящ стабилизатор. Основната функция на ваксината срещу бяс е да стимулира тялото да произвежда бърз имунен отговор и да произвежда защитни антитела срещу вируса на бяс, така че да предотврати инфекция, причинена от вируса, и да намали риска от заболяване.

 

 

Производственият процес на ваксината играе важна роля за осигуряване на качеството на ваксината, особено количественото определяне на някои показатели в производствения процес е по-важно. В процеса на производство на човешка ваксина срещу бяс, технологията за концентрация на ултрафилтрация е необходимо средство за производство на човешка ваксина срещу бяс. Използването на ултрафилтрационна мембрана с разумна апертура за ултрафилтрационна концентрация може ефективно да премахне ендотоксина и протеина на гостоприемника и да запази RV антигена, което е благоприятно за производството на ваксина и подобряването на качеството. Относителната молекулна маса на RV молекулите е 350 kDa ~ 460 kDa и на теория RV може да бъде напълно уловен чрез ултрафилтрационна концентрация, като се използва мембранна касета с молекулно тегло на прихващане от 100 kDa и 300 kDa. Ендотоксинът често образува агрегатна структура в различни водни разтвори, поради степента на агрегация, размерът на молекулата е различен. Относителната молекулна маса на ендотоксиновия мономер е 10kDa ~ 20kDa, а относителната молекулна маса на неговата полимеризационна форма е 300kDa ~ 1000kDa или повече от 1000kDa. Въз основа на разликата в молекулното тегло, RV антигенът в човешката ваксина срещу бяс се запазва и ендотоксинът и протеинът на гостоприемника в човешката ваксина срещу бяс се отстраняват чрез 300kDa ултрафилтрационна мембрана.

 

В този експеримент, ултрафилтрационна мембранна касета с 300kDa апертура и 0,11m2 площ на мембраната беше използвана като обработка на малка проба за концентриране на междинни продукти от човешка ваксина срещу бяс и мембранен поток, ефективност на третиране, множествена концентрация, прихващане на антиген, отстраняване на ендотоксин , и отстраняването на протеина на гостоприемника бяха тествани.

 

2Материален метод

 

2.1 Експериментални материали

Вирус на бяс, фиксиран вирус CTN-IV щам; Vero клетки; 0.5M натриев хидроксид; 300kDa ултрафилтрационна мембранна касета (PES материал, 0,11m² площ на мембраната).

 

2.2 Експериментални методи

2.2.1 Приготвяне на разтвор за събиране на вируси

Замразените Vero клетки се реанимират в топла вода при 37 градуса ~ 39 градуса, клетъчната суспензия се изпива и след това се добавя към 199 културална среда, съдържаща 10% инактивиран телешки серум. Еднородни монослойни клетки се култивират при 37 градуса. Щамът CTN-IV се инокулира с вирус на бяс в съотношение 0.1mol/L и се култивира при 37 градуса. След 48 часа културалната среда се изхвърля и се добавя 199 културална среда, съдържаща 0,1% албумин от човешка кръв, за да се поддържа културата при 33 градуса ~ 35 градуса. Събирайте отровата на болестта веднъж на всеки 3d-5d и комбинирайте множеството събрани течности.

 

2.2.2 Инсталиране на мембранната касета

Инсталирайте мембранната касета и свържете кабелите, както е показано на фигурата по-долу.

 

2.2.3 Измиване с вода

Затворете входящия клапан, връщащия клапан и проходния клапан и поставете връщащия край и проходната крайна тръба в резервоара за отпадъчна течност. Напълнете всмукателния резервоар с 1 L вода за инжектиране.

Отворете входящите и връщащите клапани, затворете проходните клапани, отворете помпата, почистете връщащата линия с 10% обем пречистена вода или вода за инжектиране и поддържайте входящото налягане на 0,35 bar (5psi).

Отворете филтърния клапан, затворете връщащия клапан и използвайте останалата вода за инжектиране, за да почистите филтърната тръба, като поддържате TMP на 0.35bar.

 

2.2.4 Дезинфекция

Затворете входящия клапан, връщащия клапан и трансмисионния клапан и поставете връщащия край и крайните на трансмисионните линии в резервоара за отпадъчна течност. Напълнете всмукателния резервоар с 2 L почистващ разтвор.

Отворете входящите и връщащите клапани, затворете проходните клапани, отворете помпата, почистете връщащата линия с 200mL 0,5M натриев хидроксид и поддържайте входящото налягане на 0,35 бара (5psi) .

Отворете проходния клапан, затворете връщащия клапан и почистете проходния тръбопровод с 200mL обем почистващ разтвор, като поддържате TMP на 0,35 бара.

След това обратният край и проходната крайна тръба се вкарват в резервоара за течност за циклично почистване. Цикъл на почистване с 1 ~ 1,5 пъти скоростта на тангенциалния поток на процеса за 30 минути.

Изцедете 0.5M натриев хидроксид и изплакнете с вода за инжекции съгласно 2.2.4 до неутрално състояние.

 

2.2.5 Тест за воден поток

Добавете пречистена вода към входящия резервоар, измерете и запишете температурата на водата във входящия резервоар. Поставете връщащия край в резервоара. Стартирайте помпата и регулирайте скоростта на помпата и възвратния клапан, за да постигнете 0.35bar (5psi) разлика в трансмембранното налягане. Като използвате цилиндър, измерете и запишете скоростта на потока в края на потока в mL/min. Регулирайте скоростта на помпата и възвратния клапан, за да получите 1 bar (15 psi) трансмембранно диференциално налягане. Като използвате цилиндър, измерете и запишете скоростта на потока в края на потока в mL/min.

За да стандартизирате стойността на водния поток, разделете изчислената стойност на водния поток на трансмембранната разлика в налягането и умножете коефициента на корекция на температурата в следната таблица.

 

2.2.6 Ултрафилтрационна концентрация

Измийте водата от системата с буферния капак. Цикълирайте за 5 минути, за да регулирате pH и йонната стабилност на системата. Ако температурата трябва да се регулира, продължете цикъла, докато температурата на системата се стабилизира.

Добавете захранващата течност към всмукателния резервоар, задайте скорост на потока на захранване (напр. 400LMH) и тествайте скоростта на потока при различни стойности на TMP. Според данните от теста, кривите са начертани с TMP като абциса и Flux като ордината.

Насочете проходния край на тръбата в подходящ контейнер или дренаж, като резервоари за събиране на проходен край, резервоари за отпадъчни течности и технологични дренажи.

Запишете първоначалното тегло на захранващата течност в захранващия резервоар, стартирайте захранващата помпа и бавно циркулирайте захранващата течност за 3 минути до 4 минути. Рециркулацията може да помогне за премахване на остатъчния въздух в пътя на потока, като по този начин увеличи максимално ефективността на филма.

Отворете проходния вентил, бавно увеличете скоростта на помпата, докато се достигне оптималният тангенциален дебит, и регулирайте връщащия клапан, за да постигнете оптималния TMP на системата.

След това поставете тръбата в контейнера за събиране, започнете да измервате времето, когато течността навлезе в контейнера, и запишете входното и връщащото налягане на подходящи интервали и запишете качеството на течността във времето във връщащия край и през края, за да изчислите моментното дебит.

Ултрафилтрационната концентрация на пробата е завършена, когато течният обем на захранването се намали до обема на целевата концентрация.

 

2.2.7 Диализа

Поставете всмукателната тръба, тръбата за попълване и тръбата за връщане във всмукателния резервоар, поставете трансмисионната тръба в контейнера за събиране и поставете контейнера за събиране на везната, за да изчистите.

Отворете връщащия клапан, стартирайте входящата помпа, отворете проходния клапан, регулирайте скоростта на помпата и TMP на подходящата стойност. Отворете помпата за допълване, поддържайте обема на течността във всмукателния резервоар непроменен и започнете диализа с равен обем. Започнете да измервате времето, когато течността влезе в контейнера и запишете налягането във входния край, връщащия край и масата на течността в подходящия интервал от време и получете моментния дебит чрез изчисление.

 

2.2.8 CIP

Първо изплакнете с буфер, след това изплакнете с вода за инжектиране (операция 2.2.3), след това почистете с почистващ препарат (операция 2.2.4) и накрая изплакнете с вода за инжектиране (операция 2.2.3).

 

2.2.9 Тест за воден поток

Операцията е както следва: 2.4.5.

 

2.2.10 Консервиране на мембранна касета

Краткосрочно съхранение (По-малко от или равно на 3 дни), дръжте мембранната касета в приспособлението и използвайте разтвора за съхранение, за да циклите за 10 минути до 15 минути, затворете вентила на системата, прекъснете захранването на помпата за течност и се уверете, че че входният резервоар за течност е правилно запечатан.

Ако времето за съхранение е от 3 дни до 1 месец, моля, извадете мембранната касета от приспособлението и я запечатайте в найлонов плик или друг херметичен контейнер. Добавете около 50 ml до 100 ml от разтвора за съхранение в найлонов плик или херметически затворен контейнер и го запечатайте. Или може да се потопи директно в разтвора за съхранение. Следната таблица препоръчва условия за съхранение.

 

3 Резултати и анализ

 

3.1 Изследване на факторите, влияещи върху ефективността на отстраняване на пироген

Работно налягане при ултрафилтрация: 15 тестови партиди бяха проведени непрекъснато. Във всяка партида налягането на филтриране се поддържа при 5, 10, 15 и 2{{10}}psi по време на ултрафилтрация и течността за събиране на вируса се концентрира 30 пъти и се елуира с буферна течност (10 пъти обема) в непрекъснат поток. Резултати, както е показано в таблицата по-долу, степента на отстраняване на ендотоксина е по-малка от 87,0%, степента на възстановяване на антигена е стабилна при 86,0%, а скоростта на отстраняване на протеина на гостоприемника е стабилна при 90,0%, което показва че различните работни налягания имат малко влияние върху ефекта от възстановяването на антигена, отстраняването на ендотоксина и отстраняването на протеина на гостоприемника.

Коефициент на концентрация на ултрафилтрация: 15 тестови партиди се провеждат непрекъснато. Във всяка партида течността за събиране на вируса беше концентрирана съответно 30 пъти, 50 пъти, 80 пъти и 100 пъти по време на ултрафилтрация. Налягането на филтриране се поддържа при 20 psi и буферната течност (10 пъти обема) се елуира в непрекъснат поток. Резултати, както е показано в таблицата по-долу, степента на отстраняване на ендотоксина варира от 53,3% до 86.9%, степента на възстановяване на антигена остава стабилна на 86.0%, а степента на отстраняване на протеина на гостоприемника беше стабилен на 91,0%. При сегментирано вземане на проби не беше открит антиген в предавателния разтвор и по-малко от 10% от протеина на гостоприемника остава в концентрирания вирусен разтвор. Концентрацията на ендотоксин в концентрирания разтвор на вируса се увеличава с увеличаването на концентрацията пъти, а скоростта на отстраняване на ендотоксина е най-висока в концентрираната проба от 80 пъти, а производителят може също да вземе предвид концентрацията от 100 пъти, което не само подобри ефективността на производството и намали разходите, но също така отговори на изискванията за производство на ваксини.

 

3.2 Изчерпване на потока на мембранната касета и регенериране на почистване

След третиране степента на възстановяване на мембранния поток е 92,6%. Първата скорост на възстановяване на новата мембранна касета е нормална, според текущите свойства на наблюдение на захранващата течност, последващото прогнозиране на втория и NTH пъти, скоростта на възстановяване на потока на мембранната касета ще бъде близка до данните след тази обработка и са склонни да бъдат стабилни. В рамките на 2 часа от еднократна употреба, изчерпването на мембранната касета беше идеално и само 10% от мембранния поток беше изчерпан при цялостна работа.

3.2.1 Изчерпване на потока в процеса на обработка на мембранна касета

3.2.2 Резултат от почистване и регенериране на мембранна касета

 

Относно Guidling

 

Guidling Technology е национално високотехнологично предприятие, фокусирано върху биофармацевтични продукти, клетъчни култури, пречистване и концентрация на биомедицина, диагностика и индустриални течности. Ние успешно разработихме центробежни филтърни устройства, ултрафилтрационни и микрофилтрационни касети, вирусен филтър, TFF система, дълбочинен филтър, кухи влакна и т.н. Които напълно отговарят на сценариите за приложение на биофармацевтични продукти, клетъчни култури и т.н. Нашите мембрани и мембранни филтри се използват широко при концентрация, екстракция и разделяне на предварителна филтрация, микрофилтрация, ултрафилтрация и нанофилтрация. Нашите многобройни продуктови линии, от малка лабораторна филтрация за еднократна употреба до производствени филтриращи системи, тестове за стерилност, ферментация, клетъчни култури и други, отговарят на нуждите от тестване и производство. Guidling Technology очаква с нетърпение да си сътрудничи с вас!